Разработка набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени

• Казанцев Алексей Васильевич
• Алексеев Яков Игоревич
• Чухраля Олег Васильевич
• Варламов Дмитрий Александрович
• Карулина Наталья Васильевна
• Сизикова Татьяна Евгеньевна
• Павельев Дмитрий Игоревич
• Петров Александр Анатольевич
• Маношкин Александр Владимирович
• Кузубов Алексей Владимирович
• Хмуренко Степан Никитович
• Лебедев Виталий Николаевич
• Кутаев Дмитрий Анатольевич
• Мельников Денис Геннадьевич
• Борисевич Сергей Владимирович

Резюме

При отсутствии средств профилактики и лечения новых и вновь возникающих вирусных инфекций приоритетным направлением борьбы с распространением заболевания становится разработка средств раннего выявления и идентификации возбудителя.

Цель исследования - разработка и апробация набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ).

Материал и методы. В работе использованы 2 штамма вируса SARS-CoV-2, 1 штамм вируса MERS-CoV, 4 штамма вируса гриппа А, по 1 штамму респираторно-синцитиального вируса, Haemophilus influenza type B, Human respirovirus 1, Rhinovirus и 3 штамма коронавирусов человека hCoV-229Е, hCoV-OC43, hCoV-NL63, из которых выделяли препараты нуклеиновых кислот. Нуклеотидные последовательности кДНК геномной РНК вируса SARS-CoV-2 выравнивали с помощью программы Muscle (v.3.6). Выявление видоспецифичных отличий осуществляли просмотром выравненных нуклеотидных последовательностей. Компьютерный анализ хроматограмм после секвенирования осуществляли с помощью программы Sequencher (v.4.0.5) “Gene Codes”, США. Анализ последовательностей проводили при помощи программы Genome Analysis Toolkit (v.3.6) Проведена статистическая обработка результатов, рассчитывали среднюю величину и стандартное отклонение.

Результаты. В качестве гена, на котором расположен участок гибридизации олигонуклеотидных праймеров, выбран ген ORF-1ab. Олигонуклеотидные праймеры и зонд, используемые в ПЦР, имеют специфическую область гибридизации - позиции нуклеотидных остатков 5327-5518 в составе генома вируса SARS-CoV-2 в области указанного гена.

Заключение. Преимущества разработанного диагностического набора по сравнению с существующими в России и за рубежом аналогами заключаются в том, что чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора составляет 1×10³ ГЭ/см³, и это позволяет минимизировать риск получения ложноотрицательных результатов при проведении исследования клинических проб от людей с подозрением на COVID-19.

Ключевые слова:обратная транскрипция; полимеразная цепная реакция в реальном времени; набор реагентов; праймеры; зонд; чувствительность метода; специфичность метода; воспроизводимость метода; коронавирусы; вирус SARS-CoV-2; COVID-19

В 2019 г. в Китайской Народной Республике (КНР) выявлено новое коронавирусное заболевание, вызываемое вирусом SARS-CоV-2, которое впоследствии получило название COVID-19. 31 декабря 2019 г. власти КНР передали информацию о вспышке во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ), а 11 марта 2020 г. ВОЗ объявила пандемию COVID-19, которая затронула более 200 стран. На протяжении нескольких лет COVID-19 представляет глобальную угрозу не только для здравоохранения, но и для экономических отношений, политической и культурной жизни человечества [1-4].

На первом этапе пандемии COVID-19 приоритетным направлением была разработка средств выявления и идентификации возбудителя. Ведущее значение при создании диагностических тест-систем занимают методы молекулярной биологии и молекулярной генетики.

Цель исследования - разработка и апробация набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ).

Материал и методы

В работе использованы следующие штаммы: вирус SARS-CoV-2 (изолят В и hCov-19/Russia/Gam-Omicrоn/2021); вирус SARS-CoV (штамм СоД); вирус MERS-CoV (штамм VVI); вирус гриппа А (H1N1) - штамм А/Киров/Россия/2011; вирус гриппа А (H2N2) - штамм К-46; вирус гриппа А (H3N2) - штамм A/Hong Kong/4801/14; вирус гриппа А (H5N1) - штамм Курган; респираторно-синцитиальный вирус (штамм Long); Haemophilus influenza type B (штамм АТСС 49247); Human respirovirus 1 (штамм С-39); Rhinovirus (штамм Рино/13/Ленинград/79), а также коронавирусы hCoV-229Е, hCoV-OC43, hCoV-NL63.

Препараты нуклеиновых кислот вируса SARS-CoV-2 и других микроорганизмов выделяли из культур музейных штаммов, полученных из коллекции микроорганизмов I-II групп патогенности ФГБУ "48 ЦНИИ" Минобороны России (Сергиев Посад, Россия).

Исследования с H. influenza type B (штамм АТСС 49247), Human respirovirus1 (штамм С-39) и Rhinovirus (штамм Рино/13/Ленинград/79) проведены на лабораторной базе ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России.

Культуру E. coli, штамм JM-109, культивировали на среде LB, pH 7,5, содержащей бактопептон, бактодрожжевой экстракт, хлорид натрия, с добавлением 25 мг/мл ампициллина, при температуре от 37 до 37,5 °С.

Постоянные культуры клеток Vero B, Vero E6, Vero C1008 и GMK-AH-1D получали из отдела клеточных культур и гибридомных технологий ФГБУ "48 ЦНИИ" Минобороны России.

В исследованиях использовали плазмиду pGMT (Promega, США). Проводили прямое клонирование ПЦР-продукта, при этом получили рекомбинантную плазмиду. Клонированные участки изучали путем секвенирования по Сенгеру. Синтетическую РНК с гомологичной последовательностью геному вируса SARS-CoV-2 получали с помощью данной плазмиды и Т7 РНК-полимеразы (Fermentas, Литва). Маркерным признаком исходного вектора является устойчивость к ампициллину. По данным рестриктного анализа подтверждено наличие сайтов, узнаваемых рестриктазами ApaI, AatII, SphI, BstZI (2 сайта рестрикции), NcoI, SacII, SpeI, NotI, BszI, PstI, SalI, NdeI, SacI, BstXI, NsiI. Размер векторной части составляет 3000 п.о.

Структурные элементы векторной части: промотор фага Т7, orifl, сайт полиаделирования вируса SV40, промотор SV40, кодирующая область βD-галактозидазы, позволяющая проводить "цветной" скрининг клонов, множественный сайт клонирования.

Синтетические одноцепочечные ДНК-матрицы были синтезированы твердофазным химическим синтезом. В дальнейшем, используя данные матрицы и Т7 РНК-полимеразу (Fermentas, Литва), получали гомологичную синтетическую РНК. Исходные препараты синтетической РНК делили на аликвоты и хранили при температуре не выше -70 °С, а рабочие разведения - от -20 до -18 °С.

Высокоочищенные препараты плазмидных ДНК получали с использованием модифицированной специалистами ФГБУ "48 ЦНИИ" Минобороны России методики, разработанной в лаборатории Cold Spring Harbor [5].

Вируссодержащие материалы подготавливали в условиях второй санитарной зоны. Для анализа использовали пробы в жидком виде. Пробы с органной структурой предварительно гомогенизировали, готовили суспензии на растворе Хенкса с 2% содержанием фетальной телячьей сыворотки, с добавлением антибиотиков.

Экстракцию нуклеиновых кислот осуществляли с помощью набора реагентов "М-Сорб-ООМ" ("Синтол", Россия), согласно протоколу, входящему в инструкцию к данному набору. После окончания экстракции пробирки с элюатом, содержащим нуклеиновые кислоты (НК), обрабатывали перекисью водорода и передавали через шлюз в первую санитарную зону. Полученные препараты РНК хранили при температуре не выше -70 °С, рабочие аликвоты хранили при температуре от -20 до -18 °С.

Нуклеотидные последовательности кДНК геномной РНК вируса SARS-CoV-2 выравнивали с помощью программы Muscle (v.3.6) [6]. Видоспецифичные отличия выявляли просмотром выравненных нуклеотидных последовательностей.

Компьютерный анализ хроматограмм после секвенирования осуществляли с помощью программы Sequencher (v.4.0.5) Gene Codes, США [7].

Анализировали последовательности при помощи программы Genome Analysis Toolkit (v.3.6) [8], выравнивание последовательностей - при помощи программы Ugene (v.1.24.1) [9]. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с учебными пособиями [10, 11]. Рассчитывали среднюю величину и стандартное отклонение.

Результаты и обсуждение

Использование полимеразной цепной реакции для выявления возбудителя COVID-19

ПЦР - универсальный, чувствительный и быстрый метод выявления возбудителя любого инфекционного заболевания. Первым необходимым шагом при конструировании набора реагентов для обнаружения геномной РНК возбудителя с помощью ПЦР является выбор конкретной модификации метода. Среди многочисленных вариантов методов, основанных на амплификации геномной РНК, в последнее время приоритетное место занимает ОТ-ПЦР-РВ. Данный метод включает одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце. Его принципиальными особенностями являются мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов, что определяет его востребованность при проведении диагностических исследований.

При конструировании набора реагентов важнейшим элементом является выбор специфических компонентов, к которым для метода ПЦР-РВ относятся олигонуклеотидные праймеры и зонды, а также положительный контрольный образец.

При подборе олигонуклеотидных праймеров необходимо определение участка их гибридизации на комплементарной ДНК (кДНК) геномной РНК.

Геном вируса SARS-CoV-2 представлен одноцепочечной "плюс" РНК, кодирующей 10 открытых рамок считывания (ORF). Размер генома составляет 29 903 нуклеотидных остатков (н.о). Структура генома сходна с таковой для других коронавирусов: 5’-нетранслируемый регион (№ позиций генома 1-265), гены репликазного комплекса (открытые рамки считывания ORF-1ab, № позиций генома 266-21555), ген S (21563-25384), ген ORF-3А (25393-26220), ген Е (26245-26472), ген М (26523-27191), ген ORF-6 (27202-27387), ген ORF-7 (27394-27759), ген ORF-8 (27894-28259), ген N (28274-29533), ген ORF-10 (29556-29674), 3’-нетранслируемый регион (29675-29903) [12].

Обоснование структуры специфических компонентов набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2

В соответствии с данными предыдущих разработок при создании наборов реагентов для выявления РНК родственных с SARS-CoV-2 вирусов SARS-CoV и МЕRS-CoV в качестве гена, на котором расположен участок гибридизации олигонуклеотидных праймеров, выбран ген ORF-1ab. Олигонуклеотидные праймеры и олигонуклеотидный зонд, используемые в ПЦР, имеют специфическую область гибридизации - позиции нуклеотидных остатков (н.о.) 5327-5518 в составе генома вируса SARS-CoV-2 в области указанного гена.

При выборе структуры олигонуклеотидных праймеров придерживались общепринятых критериев (размер праймера должен быть 16-25 нуклеотидов, содержание С+G 45-55%, последние несколько нуклеотидов 3’-конца праймера должны содержать СG-нуклеотидные остатки, праймеры не должны быть само- и взаимокомплементарны, отсутствие комплементарности между 3’-концами прямого и обратного праймеров, область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой либо иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров специфичности). Структура олигонуклеотидных праймеров и зонда, используемых в наборе реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, представлена в табл. 1.

Выравнивание представленных олигонуклеотидных последовательностей на соответствующие последовательности других известных коронавирусов, в том числе SARS-CoV и МЕRS-CoV, показало очень малую вероятность гибридизации и в соответствии с этим невозможность амплификации гетерологичных коронавирусов (табл. 2).

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что в связи со значительным количеством нуклеотидных замен амплификация гетерологичных коронавирусов с помощью разработанных праймеров и зонда невозможна.

Следовательно, использование при постановке ОТ-ПЦР-РВ разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда позволяет минимизировать риски получения ложноположительных результатов при проведении диагностики COVID-19.

Олигонуклеотидные праймеры и зонд были синтезированы путем твердофазного химического синтеза с последующей очисткой методами электрофореза в полиакриламидном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Оценка чувствительности и специфичности обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени при использовании разработанного набора реагентов

Важной характеристикой диагностической тест-системы является показатель чувствительности. Поскольку у ряда инфицированных (особенно вирусом SARS-CoV-2, относящимся к менее вирулентной линии S) заболевание протекает без выраженных симптомов, но при этом осуществляется трансмиссия возбудителя, повышение чувствительности используемого метода приводит к снижению вероятности получения ложноотрицательных результатов [13].

В силу одной из особенностей COVID-19 [относительно низкая концентрация возбудителя в исследуемых клинических пробах, в ротоглоточных смывах - примерно 1×10⁵ геномных эквивалентов (ГЭ)/мл] при сравнительной оценке различных амплификационных наборов реагентов показатель чувствительности метода при использовании конкретного набора реагентов имеет определяющее значение.

Чувствительность, специфичность, воспроизводимость метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных специфических компонентов набора реагентов определяли с помощью культуры вируса SARS-CoV-2 из государственной коллекции вирусов ФГБУ "48 ЦНИИ" Минобороны России.

Определение аналитической чувствительности биологическим (вирусологическим) методом проводили следующим образом. Путем разведений (выполненных двукратным шагом) культуры вируса готовили пробы, содержащие различные количества ГЭ. Полученные препараты подвергали анализу с помощью ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда. Результаты анализа, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что при использовании разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда ОТ-ПЦР-РВ позволяет специфично выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в препаратах с концентрацией не менее 1,0×10³ ГЭ/см³. Суммарное количество положительных определений для концентрации 1,0×10³ ГЭ/см³ составляет 20 из 20, что соответствует воспроизводимости не менее 95% [10]. Следовательно, аналитическая чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора реагентов составляет 1,0×10³ ГЭ/см³ с воспроизводимостью не менее 95%.

Установлено сохранение высокой чувствительности метода при использовании разработанного набора реагентов при анализе различных вариантов вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта дельта (В.1.Б.17).

Для экспериментального исследования аналитической специфичности набора реагентов использовали препараты НК, полученные из вирусов, представляющих различные таксономические группы - возбудители острых респираторных заболеваний: коронавирусы SARS-CoV, MERS-CoV, hCoV-OC43, hCoV-229Е, вирусы гриппа А (антигенные подтипы H1N1, H2N3, H5N1). Критерием специфичности служило наличие флюоресцентного сигнала по каналу R6G при анализе препаратов РНК вируса SARS-CoV-2 и отсутствие сигнала по данному каналу при анализе гетерологичных РНК и ДНК. Анализ проводили в трех повторностях с использованием критерия "единственного различия" - аналит обнаружен/аналит не обнаружен.

Критерий, согласно которому набор реагентов считали выдержавшим испытания на аналитическую специфичность: истинно положительный результат в отношении РНК вируса SARS-CoV-2 при истинно отрицательном результате в отношении всех остальных аналитов.

Данные экспериментального исследования, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что испытываемый набор реагентов обладает специфичностью в отношении вируса SARS-CoV-2. Штаммы гетерологичных микроорганизмов, в том числе возбудителей опасных коронавирусных инфекций SARS и MERS, не выявляются.

В ходе проведения исследований показана возможность использования специфичных компонентов набора реагентов в лиофильно-высушенном состоянии, что делает необязательным соблюдение "холодовой цепи" при транспортировке набора реагентов.

Исследования образцов клинического материала при использовании разработанного набора реагентов

Поскольку ПЦР-анализ клинического образца включает 3 основных этапа: пробоподготовку, амплификацию и регистрацию результатов, разработанный набор реагентов содержит все компоненты (специфические и неспецифические), необходимые для обеспечения перечисленных выше этапов исследования.

Результаты исследования образцов клинического материала, не контаминированных и контаминированных вирусом SARS-CoV-2, при использовании ОТ-ПЦР-РВ с разработанным набором реагентов представлены в табл. 5.

Заключение

В результате проведенных исследований разработан и апробирован набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ. Преимущество характеристик разработанного набора по сравнению с существующими в России и за рубежом аналогами состоит в том, что чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора составляет 1×10³ ГЭ/см³, что позволяет минимизировать риск получения ложноотрицательных результатов при проведении исследования клинических проб от людей с подозрением на COVID-19. Получено регистрационное удостоверение № РЗН 2020/9969 от 03.04.2020 на медицинское изделие "Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-19, методом ОТ-ПЦР-РВ". Новизна достигнутых результатов подтверждена патентом РФ на изобретение [13].

ЛИТЕРАТУРА

1. Li Q., Guan X., Wu P., Wang X., Zhou L. et al Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia // N. Engl. J. Med. 2020. Vol. 382, N 13. P. 1199-1207. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001316 PMID 31995857.

2. Hu D.S., Azhar E.I., Madani T.A. et al. The continuing COVID-2019 epidemic threat of novel coronaviruses in global health. The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan China // Int. J. Infect. Dis. 2020. Vol. 91. Р. 264-266.

3. Riou J., Althaus C.L. Pattern of early human-to-human transmission of Wuhan 2019 novel coronavirus (2019-nCoV), December 2019 to January 2020 // Eurosurveillance. 2020. Vol. 25, N 4. DOI: https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.4.2000058

4. Wu J.T., Leung K., Bushman M., Kishore N. et al. Estimating clinical severity of COVID-19 from the transmission dynamics in Wuhan, China // Nat. Med. 2020. Vol. 26, N 4. P. 506-510. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0822-7

5. Molecular Cloning (A Laboratory Manual) / eds J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

6. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 1792-1797.

7. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24. P. 1596-1599.

8. McKenna A., Hanna M., Banks E. et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data // Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 1297-1303.

9. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. P. 1166-1167.

10. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. Москва, 1967. 208 с.

11. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва : Высшая школа, 1990. 332 с.

12. Wu F., Zhao S., Yu B. Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome: GenBank MN908947.3. Bethesda, MD, 2020. 12 January.

13. Патент РФ № 2732608 с приоритетом от 09.04.2020 г. "Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-19, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени". Авторы Алексеев Я.И., Борисевич С.В., Варламов Д.А., Казанцев А.В., Карулина Н.В., Кириллов И.А. и др.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)