Выявление РНК вируса денге в различных биологических жидкостях

Резюме

Для лабораторного подтверждения диагноза "лихорадка денге" (ЛД) используют определение NS-1-антигена методом иммунохроматографии, РНК вируса денге (DENV) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и детекцию специфических IgM. Первые 2 метода применяют для ранней диагностики ЛД, определение антител - для ретроспективной диагностики или в случае отрицательного результата прямых методов. Для достижения наибольшей диагностической эффективности ОТ-ПЦР необходимо правильно выбрать исследуемый клинический материал на разных этапах заболевания.

Цель исследования - определение РНК DENV в различных биологических жидкостях в остром периоде болезни и в период реконвалесценции.

Материал и методы. Медицинские карты пациентов, госпитализированных и наблюдавшихся амбулаторно в ГБУЗ ИКБ № 1 ДЗМ.

Критерии отбора карт - лабораторно подтвержденные случаи ЛД с выполненной ОТ-ПЦР в пробах плазмы крови, мочи, слюны. Исследование проведено в 2 этапа: на I этапе проанализировано 182 медицинские карты и 546 образцов крови, слюны и мочи, взятых с 1-го по 13-й день заболевания. Во II этап включено 10 карт пациентов, перенесших ЛД, с исследованием образцов крови, мочи, слюны, собранных на 3-4, 5-7, 8-10-й неделях заболевания.

Для количественных данных при нормальном распределении проводили расчет среднего арифметического и среднеквадратичного отклонения, при ненормальном - медианы с указанием 1-го и 3-го квартилей. Для анализа непараметрических данных определяли экстенсивный показатель с расчетом 95% доверительного интервала (ДИ), для сравнения значимости различий использован критерий χ2 Пирсона и точный критерий Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение. В остром периоде болезни РНК DENV обнаружена в 97,8% образцов плазмы крови, в 90,7% проб мочи и 80,2% - слюны. В 4 случаях РНК DENV была выявлена только в моче при отрицательном результате исследования плазмы крови. В периоде реконвалесценции на 3-4-й неделе РНК DENV была определена в моче у всех 8 обследованных пациентов. Предельные сроки обнаружения РНК вируса денге в крови и слюне составили 22 и 21 день соответственно. Максимальный срок обнаружения РНК DENV в моче - 66 сут от начала болезни.

Заключение. Одновременное определение РНК DENV в пробах крови и мочи увеличивает диагностическую значимость ПЦР в диагностике ЛД, в то время как тестирование образцов слюны для выявления РНК DENV имело меньшую информативную ценность. В связи с этим поиск РНК DENV в пробах мочи в периоде реконвалесценции может быть использован как дополнительный прямой метод диагностики.

Ключевые слова:вирус денге; РНК; полимеразная цепная реакция; кровь; слюна; моча

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии финансирования (включая гранты и иные источники финансирования) при подготовке статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Зверева Н.Н., Сайфуллин Р.Ф., Карань Л.С.; сбор и обработка материала - Сайфуллин Р.Ф., Сайфуллин М.А., Григорьева Я.Е., Морозкин Е.С.; статистическая обработка - Сайфуллин Р.Ф., Сайфуллин М.А.; написание текста - Сайфуллин М.А., Карань Л.С.; редактирование - Сметанина С.В., Пшеничная Н.Ю., Зверева Н.Н.

Для цитирования: Зверева Н.Н., Карань Л.С., Сайфуллин Р.Ф., Григорьева Я.Е., Морозкин Е.С., Пшеничная Н.Ю., Сметанина С.В., Сайфуллин М.А. Выявление РНК вируса денге в различных биологических жидкостях // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 12, № 2. С. 42-48. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2023-12-2-42-48

Присутствие РНК трансмиссивных флавивирусов в разных биологических средах организма общеизвестно. Однако длительность персистенции возбудителя и связанная с этим эпидемиологическая опасность потенциального источника инфекции дискутируются. Если нетрансмиссивная горизонтальная передача вируса Зика очевидна, то в отношении вируса денге, помимо реализации артифициального механизма передачи возбудителя (трансфузия компонентов крови, трансплантация и др.), лишь в нескольких источниках описана возможность передачи половым путем [1, 2]. Известны случаи заражения при гетеросексуальном вагинальном контакте в 1-е сутки болезни мужчины от женщины [1] и при гомосексуальном контакте без уточнения его сроков по отношению к появлению симптомов [2]. Присутствие возбудителя в крови и моче в первые 2 нед болезни описано в ряде исследований [3-6].

В исследовании D. Van den Bossche и соавт. у людей, перенесших лихорадку денге (ЛД), концентрация РНК в моче достигала максимума к 10-му дню и становилась неопределяемой через 3-4 нед после начала заболевания [3]. В исследовании E.M. Korhonen и соавт. установлено, что на 1-й и 2-й неделях болезни РНК в моче присутствовала в 64 и 72% случаев соответственно [4]. В слюне на 1-й неделе РНК DENV определена не более чем в 60% проб и с течением времени ее содержание снижалось. В работе Т. Hirayama и соавт. с участием 53 пациентов максимальный срок обнаружения РНК DENV в моче - 16 сут от начала заболевания [5]. По данным M. Humaidi и соавт., максимальный срок детекции РНК DENV в моче достигал 32 дней [6]. Имеется отдельное описание случая выявления РНК в семенной жидкости спустя 37 дней от появления клинических симптомов [7]. Описан случай обнаружения РНК DENV-2 в моче на 34-й день у женщины, вернувшейся в Россию из Египта [8].

Вышеприведенные материалы о продолжительности срока сохранения РНК DENV в биологических средах организма инфицированного человека неоднозначны.

Цель исследования - определение РНК DENV в различных биологических жидкостях в остром периоде болезни и в периоде реконвалесценции.

Материал и методы

Проведено ретроспективное аналитическое исследование для оценки сроков выявления РНК DENV в биологическом материале больных ЛД (рис. 1). Материал для исследования - 405 карт больных, госпитализированных в ГБУЗ "ИКБ № 1" ДЗМ (ИКБ № 1) в 2010-2020 гг. с верифицированным диагнозом ЛД при обнаружении РНК DENV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и/или обнаружения IgM-DENV методом MAC-ELISA. Из них отобраны 182 карты пациентов, соответствующих следующим критериям:

· точно установлен день заболевания ЛД;

· одновременный однократный сбор всех 3 образцов клинического материала проведен в первые 2 нед от начала болезни.

Для оценки продолжительности выявления РНК в периоде реконвалесценции отобраны амбулаторные карты 10 пациентов, наблюдавшихся в консультативно-поликлиническом отделении ИКБ № 1. В периоде катамнестического наблюдения определение РНК проводили в 3 контрольных точках: на 3-4, 5-7 и 8-10-й неделях от начала заболевания. При получении отрицательного результата во всех 3 типах биологических жидкостей исследование в последующих контрольных точках не проводили.

Сбор и транспортировка материала. Кровь отбирали в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) типа Vacutainer или Monovette, объем определялся техническими требованиями к пробиркам, мочу собирали в стерильные контейнеры объемом 5-10 мл. Слюну (нестимулированную) собирали в пробирки Eppendorf Tubes в объеме 1-2 мл. Транспортировали биологический материал в лабораторию для проведения исследования специальным автотранспортом с соблюдением холодовой цепи и мер биологической безопасности.

Методика постановки ПЦР. Качественное исследование проводили с использованием наборов реагентов "АмплиСенс Dengue virus-FL" для выявления РНК вируса денге и "АмплиСенс Dengue virus type-Fl" для определения и дифференциации РНК 1-4-го типов вируса денге в биологическом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Для экстракции РНК из проб плазмы крови и мочи использовали 1 мл образца, слюны - 100 мкл образца. Предел аналитической чувствительности набора "АмплиСенс Dengue virus type-Fl" при исследовании плазмы крови, мочи и слюны составил 5×103 копий/мл при экстракции РНК из 100 мкл образца и 5×102 копий/мл при экстракции РНК из 1000 мкл плазмы крови и мочи; чувствительность набора "АмплиСенс Dengue virus-Fl" составила 1×103 копий/мл при исследовании 100 мкл плазмы крови, мочи, слюны и 1×102 копий/мл при исследовании 1000 мкл плазмы крови, мочи.

Статистические методы. Статистическую обработку проводили с помощью программ MS Excel и IBM SPSS Statistics 23.0. Количественные показатели оценивали на соответствие нормальному распределению, для этого использован критерий Шапиро-Уилка (при числе исследуемых <50) или критерий Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых >50). При нормальном распределении количественных данных рассчитывали среднее арифметическое с указанием среднеквадратичного отклонения, при ненормальном распределении - в виде медианы с указанием 1-го и 3-го квартилей. Качественные признаки представлены в виде абсолютных чисел с указанием долей (%) и расчетом 95% доверительного интервала (ДИ) для долей на основе bootstrap, сравнение значимости различия частот проводили методом сопряженных таблиц (критерий χ2 Пирсона; в случае если в одной из ячеек ожидаемые значения были <10, использовали точный критерий Фишера). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Среди 182 госпитализированных были пациенты разного возраста (в том числе 12 детей до 18 лет) с примерно равномерным распределением по гендерному признаку (табл. 1). Чаще регистрировали классическую лихорадку денге (КЛД), чем геморрагическую (ГЛД) - 87,9% (95% ДИ 83-92,3) против 12,1%, (95% ДИ 7,7-17). Взятие 3 типов клинического материала (кровь, моча, слюна) проводили одномоментно, однократно, на 1-13-е сутки, средний срок заболевания составил 6 (IQR 4; 7) дней от появления симптомов. На 1-й неделе болезни материал был забран у 146 (80,2%) пациентов, на 2-й - у 36 (19,8%). У 181 больного был идентифицирован серотип вируса денге, в 1 случае серотип вируса установить не удалось. Таким образом, для анализа было отобрано 546 проб клинического материала.

В группе пациентов в периоде реконвалесценции средний возраст составил 32,9±7,0 года, количество мужчин и женщин было равным. КЛД диагностирована у 6 человек, ГЛД - у 4 (см. табл. 1).

Детекция РНК DENV в остром периоде болезни

Среди образцов плазмы крови, отобранных в остром периоде, 178 (97,8%, 95% ДИ 95,3-99,5) из 182 были положительными. На 1-й неделе РНК DENV обнаружена в 142 (97,5%, 95% ДИ 94,3-99,4) из 146 образцов плазмы крови. Самый ранний срок получения отрицательного результата - 3-й день болезни. На 2-й неделе все 36 образцов плазмы крови были положительными. Значимых различий по результатам между 1-й и 2-й неделей не обнаружено (p=0,52).

Среди образцов мочи 165 (90,7%, 95% ДИ 86,3-94,5) из 182 были положительными. На 1-й неделе РНК выявлена в 130 (89,0%, 95% ДИ 83,5-94,1) из 146 проб. На 2-й неделе РНК DENV была обнаружена в 35 (97,2%, 95% ДИ 90,6-100) из 36 образцов. Частота определения РНК в моче была выше на 2-й неделе, но значимых различий по результатам между 1-й и 2-й неделей не установлено (p=0,2).

Среди образцов слюны 146 (80,2%, 95% ДИ 73,7-85,6) из 182 были положительными. РНК DENV в слюне на 1-й неделе была обнаружена в 120 (82,2%, 95% ДИ 75,9-89,4) из 146 проб. На 2-й неделе положительными были 20 (72,2%, 95% ДИ 56,7-66) из 36 образцов слюны. Значимых различий по результатам 1-й и 2-й недель не обнаружено (p=0,24).

В 4 пробах (2,7%, 95% ДИ 0,6-5,6) из 146 на 1-й неделе заболевания (3, 5, 6, 7-й дни) РНК была обнаружена в моче при ее отсутствии в плазме крови. Не было ни одного случая выявления РНК в слюне при отсутствии ее в плазме крови и моче. При анализе данных установлено, что значимых различий в частоте обнаружения РНК DENV в моче и крови в остром периоде заболевания не было (p=0,52), тогда как в слюне частота обнаружения РНК в сравнении с образцами плазмы крови и мочи была значимо меньше (p=0,005). Сроки выявления РНК в крови, моче, слюне представлены на рис. 2.

Результаты исследования в остром периоде заболевания показывают высокую диагностическую чувствительность (более 95%) метода ПЦР с определением РНК вируса денге в плазме крови. Частота выявления РНК в моче была меньшей, при этом значимых различий между двумя данными типами клинического материала не установлено. В сравнении с исследованиями T. Hirayama и соавт., проведенным с участием 53 пациентов [5], и D. Van den Bossche с участием 21 человека [3] продолжительность обнаружения РНК DENV была сопоставимой, однако частота определения генома в моче больных, согласно результатам D. Van den Bossche и соавт., на 1-й неделе достигала 78%, с 8-го по 20-й день обнаруживалась у всех 6 пациентов, а в дальнейшем снижалась. Однако малое число исследованных образцов не позволило сделать однозначные выводы. Повышение вирурии со 2-й недели заболевания авторы связали с повышенной элиминацией вируса денге почками.

Факт детекции РНК в моче при ее отсутствии в плазме крови у 4 человек позволяет считать необходимым взятие обоих клинических образцов для исследования в остром периоде заболевания. Чувствительность определения РНК в слюне была меньше в сравнении с другими биологическими средами, составила 82% на 1-й и 72% на 2-й неделе и была значимо меньше в сравнении с этим показателем для плазмы крови и мочи. Кроме того, не выявлено ни одного положительного результата определения РНК вируса в слюне при его отсутствии в других исследованных биологических жидкостях.

Детекция РНК DENV у реконвалесцентов

В 1-й контрольной точке (3-4-я неделя от начала заболевания) у 8 пришедших на консультацию пациентов была обнаружена РНК в пробе мочи. При исследовании образцов плазмы крови результат ПЦР был положительным у 2 наблюдаемых на 21-е и 22-е сутки соответственно, в слюне - у 2 на 19-е и 21-е сутки. В 1 случае РНК вируса была обнаружена во всех 3 пробах.

Во 2-й контрольной точке (5-7-я неделя) у всех 8 наблюдаемых в крови и слюне РНК не определялась; в моче положительный результат был у 2 человек (не участвовавших в обследовании на 3-4-й неделе) на 37-й и 38-й день от начала заболевания.

В 3-й контрольной точке из 3 оставшихся под наблюдением реконвалесцентов у 2 женщин определялась РНК в моче на 54-й и 66-й дни соответственно (табл. 2). Дальнейшие наблюдения за пациентками не проводились по причине их выбывания из исследования.

Таким образом, у всех обследованных реконвалесцентов на 3-4-й неделе РНК вируса денге определялась в моче. При дальнейшем наблюдении за реконвалесцентами у 2 женщин детекция РНК в моче продолжалась до 8-й и 10-й недели. Сравнение полученных данных с данными других исследований показало, что в проведенном исследовании зафиксирован более длительный срок выявления РНК вируса денге в моче. В работе D. Van den Bossche и соавт., где 5 пациентов наблюдались после перенесенной ЛД, образцы мочи были исследованы на 1, 2-3 и 6-м месяцах от начала заболевания, после 1 мес все результаты были отрицательными. Максимальный срок выявления РНК вируса денге в моче в этом исследовании был зафиксирован на 37-й день болезни, при первичном обследовании одного пациента, однако повторное исследование на более поздних сроках не проводили [3]. В исследовании M. Humaidi и соавт. максимальный срок обнаружения РНК вируса денге в моче составил 32 дня, однако в более поздние сроки исследование образцов материала не проводили [6].

В ходе анализа опубликованных работ, в которых изучали возможную связь длительной персистенции РНК в организме человека с тяжестью, формой болезни, серотипом вируса или коморбидными заболеваниями, такой связи не было обнаружено. Стоит отметить, что из 2 женщин с длительной персистенцией РНК вируса одна не имела диагностированных хронических заболеваний, у 2-й был лекарственно компенсированный гипотиреоз после струмэктомии. У обеих пациенток сохранялись признаки астенического синдрома (жалобы на нарушение сна, зрения, выпадение волос, ломоту в коленных суставах при физической нагрузке) при отсутствии объективных признаков поражения почек.

Однако по результатам проведенного исследования с учетом малой выборки пациентов в периоде реконвалесценции нельзя объективно судить о возможных причинах длительной персистенции РНК вируса денге. В связи с этим необходимо продолжение исследования по наблюдению за реконвалесцентами лихорадки денге.

Заключение

При одновременном исследовании образцов плазмы крови и мочи не получено ни одного отрицательного результата с 1-го по 13-й день от начала заболевания, что увеличивает диагностические возможности в сравнении с использованием только одного клинического вида биоматериала. Наименьшая доля положительных результатов была детектирована в слюне. В связи с тем что ни в одном случае при отрицательном результате исследования проб плазмы крови и мочи, полученных как в острой стадии заболевания, так и в период реконвалесценции, не получено положительного результата в слюне, нет оснований рекомендовать ее как клинический материал для лабораторного подтверждения ЛД. Обнаружение РНК вируса денге в моче в периоде реконвалесценции позволяет использовать этот метод в качестве дополнительного диагностического, однако причины длительной персистенции РНК вируса денге в моче остаются неизученными и требуют дальнейших исследований.

Ограничения исследования. Поскольку пациенты чаще обращались за медицинской помощью в разгар заболевания, в исследовании было ограниченное число образцов биологического материала, полученных в 1-е сутки болезни. Учитывая низкую мотивацию у пациентов к посещению врача-инфекциониста в период реконвалесценции, в проведенной работе не отмечено фиксированных дней взятия биологического материала, что обусловило значительный разброс в сроках проведения исследования.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Lee C., Lee H. Probable female to male sexual transmission of dengue virus infection. Infect Dis (Auckl) [Electronic resource]. 2019; 51 (2): 150-2. DOI: https://doi.org/10.1080/23744235.2018.1521004

2. Liew C.H. The first case of sexual transmission of dengue in Spain. J Travel Med. 2020; 27 (1): taz087. DOI: https://doi.org/10.1093/jtm/taz087; PMID: 31776571.

3. Van den Bossche D., Cnops L., Van Esbroeck M. Recovery of dengue virus from urine samples by real-time RT-PCR. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015; 34 (7): 1361-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10096-015-2359-0; PMID: 25794553.

4. Korhonen E.M., Huhtamo E., Virtala A.M., Kantele A., Vapalahti O. Approach to non-invasive sampling in dengue diagnostics: exploring virus and NS1 antigen detection in saliva and urine of travelers with dengue. J Clin Virol. 2014; 61 (3): 353-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcv.2014.08.021; PMID: 25242312.

5. Hirayama T., Mizuno Y., Takeshita N., Kotaki A., Tajima S., Omatsu T., et al. Detection of dengue virus genome in urine by real-time reverse transcriptase PCR: A laboratory diagnostic method useful after disappearance of the genome in serum. J Clin Microbiol. 2012; 50 (6): 2047-52. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.06557-11; PMID: 22442323.

6. Humaidi M., Tien W.P., Yap G., Chua C.R., Ng L.C. Non-invasive dengue diagnostics-the use of saliva and urine for different stages of the illness. Diagnostics (Basel). 2021; 11 (8): 1345. DOI: https://doi.org/10.3390/diagnostics11081345; PMID: 34441280.

7. Lalle E., Colavita F., Iannetta M., Gebremeskel Teklè S., Carletti F., Scorzolini L., et al. Prolonged detection of dengue virus RNA in the semen of a man returning from Thailand to Italy, January 2018. Euro Surveill. 2018; 23 (18): 18-00197. DOI: https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2018.23.18.18-00197; PMID: 29741153.

8. Saifullin M.A., Laritchev V.P., Grigorieva Y.E., Zvereva N.N., Domkina A.M., Saifullin R.F., et al. Two cases of dengue fever imported from Egypt to Russia, 2017. Emerg Infect Dis. 2018; 24 (4): 813-4. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2404.172131; PMID: 29346061.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Горелов Александр Васильевич
Академик РАН, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины» Минздрава России, профессор кафедры детских болезней Клинического института детского здоровья им. Н.Ф. Филатова ФГАОУ ВО Первый МГМУ им И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), заместитель директора по научной работе ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Российская Федерация)

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»