Выявление РНК вируса денге в различных биологических жидкостях

• Зверева Надежда Николаевна
• Карань Людмила Станиславовна
• Сайфуллин Руслан Фаритович
• Григорьева Яна Евгеньевна
• Морозкин Евгений Сергеевич
• Пшеничная Наталья Юрьевна
• Сметанина Светлана Васильевна
• Сайфуллин Мухаммад Абдулфаритович

Резюме

Для лабораторного подтверждения диагноза "лихорадка денге" (ЛД) используют определение NS-1-антигена методом иммунохроматографии, РНК вируса денге (DENV) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и детекцию специфических IgM. Первые 2 метода применяют для ранней диагностики ЛД, определение антител - для ретроспективной диагностики или в случае отрицательного результата прямых методов. Для достижения наибольшей диагностической эффективности ОТ-ПЦР необходимо правильно выбрать исследуемый клинический материал на разных этапах заболевания.

Цель исследования - определение РНК DENV в различных биологических жидкостях в остром периоде болезни и в период реконвалесценции.

Материал и методы. Медицинские карты пациентов, госпитализированных и наблюдавшихся амбулаторно в ГБУЗ ИКБ № 1 ДЗМ.

Критерии отбора карт - лабораторно подтвержденные случаи ЛД с выполненной ОТ-ПЦР в пробах плазмы крови, мочи, слюны. Исследование проведено в 2 этапа: на I этапе проанализировано 182 медицинские карты и 546 образцов крови, слюны и мочи, взятых с 1-го по 13-й день заболевания. Во II этап включено 10 карт пациентов, перенесших ЛД, с исследованием образцов крови, мочи, слюны, собранных на 3-4, 5-7, 8-10-й неделях заболевания.

Для количественных данных при нормальном распределении проводили расчет среднего арифметического и среднеквадратичного отклонения, при ненормальном - медианы с указанием 1-го и 3-го квартилей. Для анализа непараметрических данных определяли экстенсивный показатель с расчетом 95% доверительного интервала (ДИ), для сравнения значимости различий использован критерий χ² Пирсона и точный критерий Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение. В остром периоде болезни РНК DENV обнаружена в 97,8% образцов плазмы крови, в 90,7% проб мочи и 80,2% - слюны. В 4 случаях РНК DENV была выявлена только в моче при отрицательном результате исследования плазмы крови. В периоде реконвалесценции на 3-4-й неделе РНК DENV была определена в моче у всех 8 обследованных пациентов. Предельные сроки обнаружения РНК вируса денге в крови и слюне составили 22 и 21 день соответственно. Максимальный срок обнаружения РНК DENV в моче - 66 сут от начала болезни.

Заключение. Одновременное определение РНК DENV в пробах крови и мочи увеличивает диагностическую значимость ПЦР в диагностике ЛД, в то время как тестирование образцов слюны для выявления РНК DENV имело меньшую информативную ценность. В связи с этим поиск РНК DENV в пробах мочи в периоде реконвалесценции может быть использован как дополнительный прямой метод диагностики.

Ключевые слова:вирус денге; РНК; полимеразная цепная реакция; кровь; слюна; моча

Присутствие РНК трансмиссивных флавивирусов в разных биологических средах организма общеизвестно. Однако длительность персистенции возбудителя и связанная с этим эпидемиологическая опасность потенциального источника инфекции дискутируются. Если нетрансмиссивная горизонтальная передача вируса Зика очевидна, то в отношении вируса денге, помимо реализации артифициального механизма передачи возбудителя (трансфузия компонентов крови, трансплантация и др.), лишь в нескольких источниках описана возможность передачи половым путем [1, 2]. Известны случаи заражения при гетеросексуальном вагинальном контакте в 1-е сутки болезни мужчины от женщины [1] и при гомосексуальном контакте без уточнения его сроков по отношению к появлению симптомов [2]. Присутствие возбудителя в крови и моче в первые 2 нед болезни описано в ряде исследований [3-6].

В исследовании D. Van den Bossche и соавт. у людей, перенесших лихорадку денге (ЛД), концентрация РНК в моче достигала максимума к 10-му дню и становилась неопределяемой через 3-4 нед после начала заболевания [3]. В исследовании E.M. Korhonen и соавт. установлено, что на 1-й и 2-й неделях болезни РНК в моче присутствовала в 64 и 72% случаев соответственно [4]. В слюне на 1-й неделе РНК DENV определена не более чем в 60% проб и с течением времени ее содержание снижалось. В работе Т. Hirayama и соавт. с участием 53 пациентов максимальный срок обнаружения РНК DENV в моче - 16 сут от начала заболевания [5]. По данным M. Humaidi и соавт., максимальный срок детекции РНК DENV в моче достигал 32 дней [6]. Имеется отдельное описание случая выявления РНК в семенной жидкости спустя 37 дней от появления клинических симптомов [7]. Описан случай обнаружения РНК DENV-2 в моче на 34-й день у женщины, вернувшейся в Россию из Египта [8].

Вышеприведенные материалы о продолжительности срока сохранения РНК DENV в биологических средах организма инфицированного человека неоднозначны.

Цель исследования - определение РНК DENV в различных биологических жидкостях в остром периоде болезни и в периоде реконвалесценции.

Материал и методы

Проведено ретроспективное аналитическое исследование для оценки сроков выявления РНК DENV в биологическом материале больных ЛД (рис. 1). Материал для исследования - 405 карт больных, госпитализированных в ГБУЗ "ИКБ № 1" ДЗМ (ИКБ № 1) в 2010-2020 гг. с верифицированным диагнозом ЛД при обнаружении РНК DENV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и/или обнаружения IgM-DENV методом MAC-ELISA. Из них отобраны 182 карты пациентов, соответствующих следующим критериям:

· точно установлен день заболевания ЛД;

· одновременный однократный сбор всех 3 образцов клинического материала проведен в первые 2 нед от начала болезни.

Для оценки продолжительности выявления РНК в периоде реконвалесценции отобраны амбулаторные карты 10 пациентов, наблюдавшихся в консультативно-поликлиническом отделении ИКБ № 1. В периоде катамнестического наблюдения определение РНК проводили в 3 контрольных точках: на 3-4, 5-7 и 8-10-й неделях от начала заболевания. При получении отрицательного результата во всех 3 типах биологических жидкостей исследование в последующих контрольных точках не проводили.

Сбор и транспортировка материала. Кровь отбирали в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) типа Vacutainer или Monovette, объем определялся техническими требованиями к пробиркам, мочу собирали в стерильные контейнеры объемом 5-10 мл. Слюну (нестимулированную) собирали в пробирки Eppendorf Tubes в объеме 1-2 мл. Транспортировали биологический материал в лабораторию для проведения исследования специальным автотранспортом с соблюдением холодовой цепи и мер биологической безопасности.

Методика постановки ПЦР. Качественное исследование проводили с использованием наборов реагентов "АмплиСенс Dengue virus-FL" для выявления РНК вируса денге и "АмплиСенс Dengue virus type-Fl" для определения и дифференциации РНК 1-4-го типов вируса денге в биологическом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Для экстракции РНК из проб плазмы крови и мочи использовали 1 мл образца, слюны - 100 мкл образца. Предел аналитической чувствительности набора "АмплиСенс Dengue virus type-Fl" при исследовании плазмы крови, мочи и слюны составил 5×10³ копий/мл при экстракции РНК из 100 мкл образца и 5×10² копий/мл при экстракции РНК из 1000 мкл плазмы крови и мочи; чувствительность набора "АмплиСенс Dengue virus-Fl" составила 1×10³ копий/мл при исследовании 100 мкл плазмы крови, мочи, слюны и 1×10² копий/мл при исследовании 1000 мкл плазмы крови, мочи.

Статистические методы. Статистическую обработку проводили с помощью программ MS Excel и IBM SPSS Statistics 23.0. Количественные показатели оценивали на соответствие нормальному распределению, для этого использован критерий Шапиро-Уилка (при числе исследуемых <50) или критерий Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых >50). При нормальном распределении количественных данных рассчитывали среднее арифметическое с указанием среднеквадратичного отклонения, при ненормальном распределении - в виде медианы с указанием 1-го и 3-го квартилей. Качественные признаки представлены в виде абсолютных чисел с указанием долей (%) и расчетом 95% доверительного интервала (ДИ) для долей на основе bootstrap, сравнение значимости различия частот проводили методом сопряженных таблиц (критерий χ² Пирсона; в случае если в одной из ячеек ожидаемые значения были <10, использовали точный критерий Фишера). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Среди 182 госпитализированных были пациенты разного возраста (в том числе 12 детей до 18 лет) с примерно равномерным распределением по гендерному признаку (табл. 1). Чаще регистрировали классическую лихорадку денге (КЛД), чем геморрагическую (ГЛД) - 87,9% (95% ДИ 83-92,3) против 12,1%, (95% ДИ 7,7-17). Взятие 3 типов клинического материала (кровь, моча, слюна) проводили одномоментно, однократно, на 1-13-е сутки, средний срок заболевания составил 6 (IQR 4; 7) дней от появления симптомов. На 1-й неделе болезни материал был забран у 146 (80,2%) пациентов, на 2-й - у 36 (19,8%). У 181 больного был идентифицирован серотип вируса денге, в 1 случае серотип вируса установить не удалось. Таким образом, для анализа было отобрано 546 проб клинического материала.

В группе пациентов в периоде реконвалесценции средний возраст составил 32,9±7,0 года, количество мужчин и женщин было равным. КЛД диагностирована у 6 человек, ГЛД - у 4 (см. табл. 1).

Детекция РНК DENV в остром периоде болезни

Среди образцов плазмы крови, отобранных в остром периоде, 178 (97,8%, 95% ДИ 95,3-99,5) из 182 были положительными. На 1-й неделе РНК DENV обнаружена в 142 (97,5%, 95% ДИ 94,3-99,4) из 146 образцов плазмы крови. Самый ранний срок получения отрицательного результата - 3-й день болезни. На 2-й неделе все 36 образцов плазмы крови были положительными. Значимых различий по результатам между 1-й и 2-й неделей не обнаружено (p=0,52).

Среди образцов мочи 165 (90,7%, 95% ДИ 86,3-94,5) из 182 были положительными. На 1-й неделе РНК выявлена в 130 (89,0%, 95% ДИ 83,5-94,1) из 146 проб. На 2-й неделе РНК DENV была обнаружена в 35 (97,2%, 95% ДИ 90,6-100) из 36 образцов. Частота определения РНК в моче была выше на 2-й неделе, но значимых различий по результатам между 1-й и 2-й неделей не установлено (p=0,2).

Среди образцов слюны 146 (80,2%, 95% ДИ 73,7-85,6) из 182 были положительными. РНК DENV в слюне на 1-й неделе была обнаружена в 120 (82,2%, 95% ДИ 75,9-89,4) из 146 проб. На 2-й неделе положительными были 20 (72,2%, 95% ДИ 56,7-66) из 36 образцов слюны. Значимых различий по результатам 1-й и 2-й недель не обнаружено (p=0,24).

В 4 пробах (2,7%, 95% ДИ 0,6-5,6) из 146 на 1-й неделе заболевания (3, 5, 6, 7-й дни) РНК была обнаружена в моче при ее отсутствии в плазме крови. Не было ни одного случая выявления РНК в слюне при отсутствии ее в плазме крови и моче. При анализе данных установлено, что значимых различий в частоте обнаружения РНК DENV в моче и крови в остром периоде заболевания не было (p=0,52), тогда как в слюне частота обнаружения РНК в сравнении с образцами плазмы крови и мочи была значимо меньше (p=0,005). Сроки выявления РНК в крови, моче, слюне представлены на рис. 2.

Результаты исследования в остром периоде заболевания показывают высокую диагностическую чувствительность (более 95%) метода ПЦР с определением РНК вируса денге в плазме крови. Частота выявления РНК в моче была меньшей, при этом значимых различий между двумя данными типами клинического материала не установлено. В сравнении с исследованиями T. Hirayama и соавт., проведенным с участием 53 пациентов [5], и D. Van den Bossche с участием 21 человека [3] продолжительность обнаружения РНК DENV была сопоставимой, однако частота определения генома в моче больных, согласно результатам D. Van den Bossche и соавт., на 1-й неделе достигала 78%, с 8-го по 20-й день обнаруживалась у всех 6 пациентов, а в дальнейшем снижалась. Однако малое число исследованных образцов не позволило сделать однозначные выводы. Повышение вирурии со 2-й недели заболевания авторы связали с повышенной элиминацией вируса денге почками.

Факт детекции РНК в моче при ее отсутствии в плазме крови у 4 человек позволяет считать необходимым взятие обоих клинических образцов для исследования в остром периоде заболевания. Чувствительность определения РНК в слюне была меньше в сравнении с другими биологическими средами, составила 82% на 1-й и 72% на 2-й неделе и была значимо меньше в сравнении с этим показателем для плазмы крови и мочи. Кроме того, не выявлено ни одного положительного результата определения РНК вируса в слюне при его отсутствии в других исследованных биологических жидкостях.

Детекция РНК DENV у реконвалесцентов

В 1-й контрольной точке (3-4-я неделя от начала заболевания) у 8 пришедших на консультацию пациентов была обнаружена РНК в пробе мочи. При исследовании образцов плазмы крови результат ПЦР был положительным у 2 наблюдаемых на 21-е и 22-е сутки соответственно, в слюне - у 2 на 19-е и 21-е сутки. В 1 случае РНК вируса была обнаружена во всех 3 пробах.

Во 2-й контрольной точке (5-7-я неделя) у всех 8 наблюдаемых в крови и слюне РНК не определялась; в моче положительный результат был у 2 человек (не участвовавших в обследовании на 3-4-й неделе) на 37-й и 38-й день от начала заболевания.

В 3-й контрольной точке из 3 оставшихся под наблюдением реконвалесцентов у 2 женщин определялась РНК в моче на 54-й и 66-й дни соответственно (табл. 2). Дальнейшие наблюдения за пациентками не проводились по причине их выбывания из исследования.

Таким образом, у всех обследованных реконвалесцентов на 3-4-й неделе РНК вируса денге определялась в моче. При дальнейшем наблюдении за реконвалесцентами у 2 женщин детекция РНК в моче продолжалась до 8-й и 10-й недели. Сравнение полученных данных с данными других исследований показало, что в проведенном исследовании зафиксирован более длительный срок выявления РНК вируса денге в моче. В работе D. Van den Bossche и соавт., где 5 пациентов наблюдались после перенесенной ЛД, образцы мочи были исследованы на 1, 2-3 и 6-м месяцах от начала заболевания, после 1 мес все результаты были отрицательными. Максимальный срок выявления РНК вируса денге в моче в этом исследовании был зафиксирован на 37-й день болезни, при первичном обследовании одного пациента, однако повторное исследование на более поздних сроках не проводили [3]. В исследовании M. Humaidi и соавт. максимальный срок обнаружения РНК вируса денге в моче составил 32 дня, однако в более поздние сроки исследование образцов материала не проводили [6].

В ходе анализа опубликованных работ, в которых изучали возможную связь длительной персистенции РНК в организме человека с тяжестью, формой болезни, серотипом вируса или коморбидными заболеваниями, такой связи не было обнаружено. Стоит отметить, что из 2 женщин с длительной персистенцией РНК вируса одна не имела диагностированных хронических заболеваний, у 2-й был лекарственно компенсированный гипотиреоз после струмэктомии. У обеих пациенток сохранялись признаки астенического синдрома (жалобы на нарушение сна, зрения, выпадение волос, ломоту в коленных суставах при физической нагрузке) при отсутствии объективных признаков поражения почек.

Однако по результатам проведенного исследования с учетом малой выборки пациентов в периоде реконвалесценции нельзя объективно судить о возможных причинах длительной персистенции РНК вируса денге. В связи с этим необходимо продолжение исследования по наблюдению за реконвалесцентами лихорадки денге.

Заключение

При одновременном исследовании образцов плазмы крови и мочи не получено ни одного отрицательного результата с 1-го по 13-й день от начала заболевания, что увеличивает диагностические возможности в сравнении с использованием только одного клинического вида биоматериала. Наименьшая доля положительных результатов была детектирована в слюне. В связи с тем что ни в одном случае при отрицательном результате исследования проб плазмы крови и мочи, полученных как в острой стадии заболевания, так и в период реконвалесценции, не получено положительного результата в слюне, нет оснований рекомендовать ее как клинический материал для лабораторного подтверждения ЛД. Обнаружение РНК вируса денге в моче в периоде реконвалесценции позволяет использовать этот метод в качестве дополнительного диагностического, однако причины длительной персистенции РНК вируса денге в моче остаются неизученными и требуют дальнейших исследований.

Ограничения исследования. Поскольку пациенты чаще обращались за медицинской помощью в разгар заболевания, в исследовании было ограниченное число образцов биологического материала, полученных в 1-е сутки болезни. Учитывая низкую мотивацию у пациентов к посещению врача-инфекциониста в период реконвалесценции, в проведенной работе не отмечено фиксированных дней взятия биологического материала, что обусловило значительный разброс в сроках проведения исследования.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Lee C., Lee H. Probable female to male sexual transmission of dengue virus infection. Infect Dis (Auckl) [Electronic resource]. 2019; 51 (2): 150-2. DOI: https://doi.org/10.1080/23744235.2018.1521004

2. Liew C.H. The first case of sexual transmission of dengue in Spain. J Travel Med. 2020; 27 (1): taz087. DOI: https://doi.org/10.1093/jtm/taz087; PMID: 31776571.

3. Van den Bossche D., Cnops L., Van Esbroeck M. Recovery of dengue virus from urine samples by real-time RT-PCR. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015; 34 (7): 1361-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10096-015-2359-0; PMID: 25794553.

4. Korhonen E.M., Huhtamo E., Virtala A.M., Kantele A., Vapalahti O. Approach to non-invasive sampling in dengue diagnostics: exploring virus and NS1 antigen detection in saliva and urine of travelers with dengue. J Clin Virol. 2014; 61 (3): 353-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcv.2014.08.021; PMID: 25242312.

5. Hirayama T., Mizuno Y., Takeshita N., Kotaki A., Tajima S., Omatsu T., et al. Detection of dengue virus genome in urine by real-time reverse transcriptase PCR: A laboratory diagnostic method useful after disappearance of the genome in serum. J Clin Microbiol. 2012; 50 (6): 2047-52. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.06557-11; PMID: 22442323.

6. Humaidi M., Tien W.P., Yap G., Chua C.R., Ng L.C. Non-invasive dengue diagnostics-the use of saliva and urine for different stages of the illness. Diagnostics (Basel). 2021; 11 (8): 1345. DOI: https://doi.org/10.3390/diagnostics11081345; PMID: 34441280.

7. Lalle E., Colavita F., Iannetta M., Gebremeskel Teklè S., Carletti F., Scorzolini L., et al. Prolonged detection of dengue virus RNA in the semen of a man returning from Thailand to Italy, January 2018. Euro Surveill. 2018; 23 (18): 18-00197. DOI: https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2018.23.18.18-00197; PMID: 29741153.

8. Saifullin M.A., Laritchev V.P., Grigorieva Y.E., Zvereva N.N., Domkina A.M., Saifullin R.F., et al. Two cases of dengue fever imported from Egypt to Russia, 2017. Emerg Infect Dis. 2018; 24 (4): 813-4. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2404.172131; PMID: 29346061.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)