Новые представители рода Orthopoxvirus

• Онищенко Геннадий Григорьевич
• Сизикова Татьяна Евгеньевна
• Лебедев Виталий Николаевич
• Борисевич Сергей Владимирович

Резюме

Оценена потенциальная опасность для здравоохранения новых представителей рода Orthopoxvirus, в качестве которых рассмотрены вирусы Ахмета, Аляска и оспы кошек.

Вирус Ахмета - новый ортопоксвирус выделенный в Ахметинском и Ванском районах Грузии в 2010 и 2013 гг. Вирус Аляска выделен в ходе поксвирусной инфекции у женщины, проживающей в штате Аляска (США) в 2015 г. Установлена связь вирусов Ахмета и Аляска с заболеванием человека.

Еще одним недавно идентифицированным ортопоксвирусом, для которого нельзя исключить в дальнейшем возможности такого рода ассоциации, является вирус оспы кошек, выделенный в Италии в 2017 г.

Данные секвенирования геномной ДНК позволяют провести видовую идентификацию вирусов Ахмета, Аляска и оспы кошек как отдельных представителей рода Orthopoxvirus и определить их место на филогенетическом древе ортопоксвирусов Старого Света. Выявление новых ортопоксвирусов определяет возрастание значения данной таксономической группы вирусов в инфекционной патологии человека.

Ключевые слова:ортопоксвирусы; вирус Ахмета; вирус Аляска; вирус оспы кошек; идентификация; ДНК; секвенирование; филогенетическое древо

Ортопоксвирусы представляют собой большие ДНК-содержащие вирусы, геном которых представлен двухцепочечной ДНК размером от 140 до 280 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), которые реплицируются исключительно в цитоплазме инфицированных клеток. Семейство Poxviridae делится на 2 подсемейства - Entomopoxvirinae и Chordopoxvirinae, которые вызывают заболевания насекомых и позвоночных соответственно. Род Orthopoxvirus входит в подсемейство Chordopoxvirinae и содержит 2 клайда, ортопоксвирусы Северной Америки (вирусы оспы енотов, оспы скунсов, оспы полевок) и ортопоксвирусы Старого Света. Последний клайд до недавнего времени включал вирусы вакцины (ВВ), натуральной оспы (ВНО), оспы обезьян (ВОО), оспы буйволов (ВОБ), эктромелии (ВЭ), оспы верблюдов (ВОВ), оспы коров (ВОКор), миксомы и фибромы Шоупа [1, 2].

Прекращение вакцинации после завершения Программы глобальной ликвидации оспы привело к опасной ситуации, так как большая часть населения земного шара стала восприимчивой к ортопоксвирусным инфекциям в результате утраты коллективного иммунитета. Отсутствие настороженности у медицинских работников по отношению к данной группе инфекционных агентов, отмена оспопрививания и связанное с ним снижение уровня коллективного иммунитета являются факторами, осложняющими прогноз развития возможных вспышек заболеваний, вызванных патогенными для человека ортопоксвирусами [3]. Низкий уровень коллективного противооспенного иммунитета может приводить к отягощению клинических проявлений заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами.

Большинство случаев ортопоксвирусных заболеваний человека ассоциировано с ВОКор. Доказано, что ВОКор имеет обширный круг хозяев. Источниками данного возбудителя, кроме парнокопытных, могут быть кошки, рыжие полевки, белые крысы, собаки и кроты. Естественными хозяевами ВОКор в природе являются дикие грызуны, но инфекция у человека часто возникает именно вследствие контактов с кошками и, реже, с экзотическими животными [4].

ВОКор широко распространен на Евразийском континенте. В последнее десятилетие число заболеваний, вызванных ВОКор, у людей и животных заметно увеличилось, что свидетельствует о росте зоонозного потенциала возбудителя и связанном с ним повышением риска заболеваний людей. Данный возбудитель вызывает локализованные дерматиты, у людей с иммунодефицитными состояниями могут развиться серьезные заболевания. Иногда они могут заканчиваться летальными исходами [5].

В последнее время выявлены заболевания человека, вызванные ранее неизвестными ортопоксвирусами. Вирус Ахмета - новый ортопоксвирус, выделенный в Ахметинском и Ванском районах Грузии.

В 2013 г. у 2 мужчин, проживающих в указанных районах, были выявлены кожные поражения после контакта с больными коровами. Эти мужчины никогда не были вакцинированы против натуральной оспы. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени, проведенная с материалом кожных повреждений, выявила ДНК ортопоксвируса. Секвенирование геномной ДНК показало, что этот вирус является новым представителем рода Orthopoxvirus, получившим название "вирус Ахмета" (по месту выделения в Ахметинском и Ванском районах Грузии). В ходе проведенного эпидемиологического расследования новых случаев заболевания у человека не обнаружено. Однако серологические исследования позволили выявить антитела к вирусу в сыворотке крови коров в пораженных болезнью стадах и у пойманных грызунов и землероек.

Третий случай заболевания, этиологическим агентом которого был вирус Ахмета, выявлен ретроспективно при анализе пробы сыворотки крови, взятой в 2010 г. у больного пастуха с подозрением на сибирскую язву [6].

В ходе определения полной последовательности генома 3 изолятов вируса Ахмета установлено, что уровень идентичности между геномными ДНК вируса Ахмета и другими ортопоксвирусами Старого Света меньше, чем между известными представителями ортопоксвирусов этого региона. Филогенетический анализ выявил, что вирус Ахмета дивергировал от общего предка ранее, чем другие ортопоксвирусы Старого Света.

Изоляты вируса Ахмета формируют монофилетический клайд на филогенетическом древе ортопоксвирусов, при этом вариабельность нуклеотидной последовательности выше, чем у монофилетических линий ВОО бассейна реки Конго и Западной Африки [6].

Изучение структуры генома вируса Ахмета показало наиболее высокую идентичность данного возбудителя с вирусом оспы коров. По сравнению с ВОКор в центральной части генома вируса Ахмета отсутствовал только ген CPXV119A, кодирующий белок размером 80 аминокислотных остатков; в то же время вирус Ахмета содержал малый ген AKMV059, отсутствующий у изолятов ВОКор. Наибольший уровень геномных различий установлен по отношению к ВЭ, в центральном регионе которого отсутствуют 7 малых генов, выявленных в центральной части генома вируса Ахмета.

В отличие от изолята вируса Ахмета, выделенного в одноименном районе, изолят, выделенный в районе Вана, содержал у 3'-концевой части последовательности генома участок размером 6 т.п.н., который проявил большее соответствие с аналогичным участком ВОКор по сравнению с другими двумя изолятами, в то время как остальная часть генома данных изолятов была сходной. Это свидетельствует о возможной рекомбинации между вирусом Ахмета и ВОКор.

Y.P. Springer и соавт. [7] описали случай новой поксвирусной инфекции у женщины, проживающей в штате Аляска (США). У больной отмечены лихорадка, слабость, недомогание, увеличение лимфатических узлов. При осмотре выявлены язва диаметром 1 см и 2 везикулы диаметром 2 мм. Тесты на вирусы простого и опоясывающего герпеса дали отрицательный результат. Серологическими исследованиями установлено, что ни у одного из контактировавших с больной не выявлено антител к этому вирусу. Источник инфицирования точно не установлен.

В результате анализа, проведенного в лаборатории поксвирусов СDС (Центр по контролю и профилактике заболеваний США) с использованием электронной микроскопии и секвенирования последовательности нуклениновых кислот, установлено, что этиологическим агентом заболевания являлся ортопоксвирус, впоследствии обозначенный как вирус Аляска (AK2015_poxvirus).

Филогенетический анализ перекрывающейся последовательности генома размером 28037 п.н. выявил, что вирус Аляска AK2015_poxvirus представляет собой отдельную генетическую линию ортопоксвирусов, которая значительно отличается как от североамериканских ортопоксвирусов, так и от ортопоксвирусов Старого Света.

Вирус Аляска входит в монофилетический клайд ортопоксвирусов Старого Света, уровень различия с отдельными видами которых составляет 6,1-7,3% (соответствующий показатель при сравнении с североамериканскими ортопоксвирусами составляет 12,3-12,8%). В этой связи следует отметить, что уровень генетических различий между сравниваемыми ортопоксвирусами Старого Света колеблется от 0,6% (в паре ВОВ - вирус оспы полевок) до 3,2% (в паре ВЭ-ВНО) [7].

Новые ортопоксвирусы - вирусы Ахмета и Аляска ассоциированы со случаями заболевания человека. Еще одним недавно идентифицированным ортопоксвирусом, для которого нельзя исключить в дальнейшем возможность вызывать болезнь у человека, является вирус оспы кошек.

G. Lanave и соавт. [8] в 2017 г. впервые описали завершившийся летальным исходом случай заболевания кошки, вызванный ранее неизвестным ортопоксвирусом. У заболевшего животного были кожные поражения, гистологически характеризующиеся инфильтрацией лейкоцитов и эозинофильными цитоплазматическими включениями. С помощью электронной микроскопии установлено, что возбудитель заболевания морфологически близок к ортопоксвирусам. На культуре клеток и в развивающихся куриных эмбрионах был выделен новый ортопоксвирус - вирус оспы кошек, штамм Italy_09/17.

Быстрая идентификация ортопоксвирусов и их дифференциация от других родов подсемейства с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР) может быть достигнута при использовании праймеров, специфичных по отношению к последовательности, кодирующей белок гемагглютинина (НА), присутствующий на мембранах инфицированных клеток. Могут быть использованы 2 пары праймеров, первая пара соответствует последовательностям североамериканских ортопоксвирусов, а вторая - для амплификации полной открытой рамки считывания гена НА для ортопоксвирусов Старого Света. В результате проведения ПЦР была установлена принадлежность выделенного возбудителя к ортопоксвирусам Старого Света [9].

Поскольку при использовании ПЦР с праймерами, специфичными для ВЭ и ВОКор, не удалось определить возбудитель как относящийся к определенному виду ортопоксвирусов, для его характеристики были проведены углубленные молекулярно-генетические исследования.

Для систематизации вновь выделенного штамма ортопоксвируса использовали стратегию, предложенную G.L. Emerson и соавт. [10].

Для анализа отобрали 9 кодирующих последовательностей генома штамма Italy_09/17: A7L - ранний транскрипционный фактор, большая субъединица; A10L - основной центральный белок; A24R - РНК-полимераза 132; D1R - информационная РНК кэпирующего фермента, большая субъединица; D5R - ДНК-зависимая нуклеотид-фосфатаза; E6R - гипотетический белок; E9L - ДНК-полимераза; H4L - белок, ассоциированный с РНК-полимеразой; J6R - РНК-полимераза 147. Гены обозначены в соответствии с таковыми для ВВ.

Выравнивание сцепленных геномных последовательностей ортопоксвирусов, представляющих Северную Америку и Старый Свет, 9 выбранных генов вируса оспы кошек, штамм Italy_09/17, с соответствующими геномными последовательностями для вирусов оспы кроликов, ВОО, ВНО, ВОКор, ВВ, ВЭ, позволило установить, что вирус оспы кошек является отдаленно родственным по отношению к другим ортопоксвирусам (см. рисунок), в том числе ко всем 10 линиям ВОКор [11] и недавно выделенным сублиниям [7, 12]. На филогенетическом древе ортопоксвирусов штамм Italy_09/17 формирует отдельный кластер, включающий также недавно выделенный от макак в Италии штамм Abatino [13].

Нуклеотидная идентичность штамма Italy_09/17 и штамма Abatino составляет 99,66%, в то время как с референтными штаммами ВЭ 98,11-98,13%. По результатам анализа гена НА уровень идентичности штамма Italy_09/17 и штамма Abatino еще выше (99,79%). Следовательно, на основании существующих критериев демаркации видов ортопоксвирусов [2] штаммы Italy_09/17 (выделенный от кошек) и Abatino (выделенный от макак) могут рассматриваться как относящиеся к одному новому ортопоксвирусу Старого Света (вирус оспы кошек).

Таким образом, новый ортопоксвирус, выделенный при летальной инфекции у кошки, ни в коем случае не может быть идентифицирован как ВОКор, широко распространенный среди семейства кошачьих. Изолированный штамм, получивший название "Italy_09/17" [8] совместно со штаммом Abatino, выделенным от макак [13], в пределах рода формируют отдельный кластер и на основании существующих критериев [2] могут рассматриваться в качестве штаммов нового ортопоксвируса Старого Света.

Выделение (в одном и том же географическом регионе) вируса оспы кошек не только от кошачьих, но и от низших приматов может указывать на то, что кошки (как и низшие приматы) являются промежуточными хозяевами возбудителя. Наиболее вероятным естественным резервуаром вируса в природе являются синантропные грызуны ввиду возможного контакта с ними (или продуктами их жизнедеятельности) как домашних кошек, так и содержащихся в лаборатории низших приматов.

Анализ опубликованных данных позволяет установить видовую идентификацию вирусов Ахмета, Аляска и оспы кошек как новых представителей рода Orthopoxvirus.

Положение новых ортопоксвирусов на филогенетическом древе ортопоксвирусов Старого Света по результатам секвенирования генов A7L, A10L, A24R, D1R, D5R, E6R, E9L, H4L, J6R [6-8] представлено на рисунке.

Выявление новых ортопоксвирусов определяет возрастание значения данной таксономической группы в инфекционной патологии человека.

Особое внимание следует обратить на данные секвенирования геномов новых ортопоксвирусов, которые позволяют предполагать возможность рекомбинации между ними и уже известными представителями рода, в результате которого возможно спонтанное появление варианта с повышенным уровнем патогенности для человека.

Кроме того, появление нового патогенного для человека ортопоксвируса с неустановленным природным резервуаром (вируса Аляска) в районе, находящемся на той же географической широте, что и палеоарктические области РФ, в которых предполагается расширение хозяйственной деятельности, требует настороженности и проведения дальнейших исследований. Последнее обстоятельство определяет необходимость мониторинга всех подозрительных случаев заболевания в приграничных регионах России (проведение скрининговых исследований на наличие ортопоксвирусов у представителей фауны районов Крайнего Севера при использовании метагеномного анализа).

ЛИТЕРАТУРА

1. Борисевич С.В., Маренникова С.С., Стовба Л.Ф., Петров А.А., Кротков В.Т., Махлай А.А. Оспа буйволов // Вопросы вирусологии. 2016. № 5. С. 200-204.

2. International Committee on Taxonomy of Viruses. Virus taxonomy: 2016 release. 2017. URL: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (дата обращения: 15.05.2018)

3. Frey S., Belshe R. Poxvirus dilemmas - putting pock into context // N. Engl. J. Med. 2004. Vol. 350. P. 324-327.

4. Essbauer S., Pfeffer M., Meyer H. Zoonotic poxviruses // Vet. Microbiol. 2010. Vol. 140. P. 229-236. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.08.026

5. Vorou R.M., Papavassiliou V.G., Pierroutsakos I.N. Cowpox virus infection: An emerging health threat // Curr. Opin. Infect. Dis. 2008. Vol. 21. P. 153-156. DOI: https://doi.org/10.1097/QCO.0b013e3282f44c74

6. Gao J., Gigante C., Khmaladze E., Liu P., Tang S., Wilkins K. et al. Genome sequences of Akhmeta virus, an early divergent old world Orthopoxvirus // Viruses. 2018. Vol. 10, N 5. pii: E252. DOI: https://doi.org/10.3390/v10050252

7. Springer Y.P., Hsu C.H., Werle Z.R., Olson L.E., Cooper M.P., Castrodale L.J. et al. Novel Orthopoxvirus infection in an Alaska resident // Clin. Infect. Dis. 2017. Vol. 64, N 12. P. 1737-1741. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/cix219

8. Lanave G., Dowgier G., Decaro N., Albanese F., Brogi E., Parisi A. et al. Novel orthopoxvirus and lethal disease in cat, Italy // Emerg. Infect. Dis. 2018. Vol. 24, N 9. P. 1665-1673. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2409.171283

9. Ropp S.L., Jin Q., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. PCR strategy for identification and differentiation of small pox and other orthopoxviruses // J. Clin. Microbiol. 1995. Vol. 33, N 8. P. 2069-2076. PMCID: PMC228337.

10. Emerson G.L., Li Y., Frace M.A., Olsen-Rasmussen M.A., Khristova M.L., Govil D. et al. The phylogenetics and ecology of the orthopoxviruses endemic to North America // PLoS One. 2009. Vol. 4. Article ID e7666. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007666

11. Mauldin M.R., Antwerpen M., Emerson G.L., Li Y., Zoeller G., Carroll D.S. et al. Cowpox virus: What’s in a name? // Viruses. 2017. Vol. 9. P. E101. DOI: http://doi.org/10.3390/v9050101

12. Vora N.M., Li Y., Geleishvili M., Emerson G.L., Khmaladze E., Maghlakelidze G. et al. Human infection with a zoonotic orthopoxvirus in the country of Georgia // N. Engl. J. Med. 2015. Vol. 372, N 13. P. 1223-1230. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1407647

13. Cardeti G., Gruber C.E.M., Eleni C., Carletti F., Castilletti C., Manna G. et al. Fatal outbreak in Tonkean macaques caused by possibly novel orthopoxvirus, Italy, January 2015 // Emerg. Infect. Dis. 2017. Vol. 23. P. 1941-1949. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2312.162098

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)