Молекулярная диагностика паразитарных болезней
РезюмеРассмотрены результаты и перспективы использования современных методов молекулярной диагностики паразитарных болезней. Описаны возможности использования полимеразной цепной реакции для диагностики протозойных болезней и дирофиляриоза.
Ключевые слова:диагностика, паразитарные болезни, полимеразная цепная реакция
Инфекц. бол.: новости, мнения, обучение. 2014. № 1. С. 36-38.
В последнее время в России отмечается все большее число паразитарных болезней, "завезенных" из эндемичных стран [1, 2]. Ситуация еще более ухудшается из-за роста оппортунистических протозойных инфекций (токсоплазмоза, криптоспоридиоза, пневмоцистоза и др.), обусловленного ослабленным иммунным статусом населения вследствие широкого распространения ВИЧ-инфекции и неблагоприятных экологических условий [9, 10].
В связи с этим существует необходимость в современных высокочувствительных методах мониторинга за паразитарными заболеваниями (лабораторная диагностика паразитозов, мониторинг за лекарственной устойчивостью возбудителей, контроль эффективности лечения, поиск внутривидовых различий паразитов и др.) [7, 8].
В настоящее время диагностика паразитарных болезней часто основывается на выявлении простейших микроскопическими методами. Иногда прибегают к культивированию на специальных средах или путем пассажей на лабораторных животных (биологическая проба). В последние годы расширился спектр иммунологических методов диагностики паразитозов. В зависимости от локализации возбудителя материалом для исследования могут быть кровь, мокрота, испражнения, образцы тканей (биоптаты), спинномозговая жидкость и др. При некоторых паразитарных болезнях используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации ДНК паразита в биологических материалах.
Внедрение метода ПЦР в широкую практику стало одним из наиболее важных событий в биологии и медицине в последнее десятилетие. Метод ПЦР поднимает диагностику на принципиально иной уровень - уровень определения специфических нуклеиновых кислот - ДНК или РНК, что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. С помощью ПЦР одна молекула искомой ДНК может быть обнаружена в присутствии миллионов других молекул ДНК в исследуемом материале.
ПЦР в настоящее время является одним из наиболее важных диагностических инструментов исследования геномов возбудителей инфекционных и паразитарных болезней. По сравнению с традиционными методами диагностики ПЦР обладает более высокой чувствительностью, специфичностью и позволяет проводить прямое определение микроорганизма непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя, что снижает трудозатраты. Такой подход наиболее информативен при диагностике внутриклеточных паразитов (малярия, лейшманиозы, токсоплазмозы и др.).
Различные варианты оборудования для ПЦР позволяют работать как в условиях полной автоматизации процесса, так и при чередовании ручных и автоматизированных этапов, что делает ПЦР доступной не только научным учреждениям и крупным медицинским центрам, но и более мелким клиническим лабораториям.
Идея открытия метода принадлежит К. Б. Мюллису, сотруднику корпорации "Цетус". В 1983 г. он разработал метод, благодаря которому in vitro можно получать копии изучаемых генов в неограниченном количестве. Этот метод, основанный на амплификации искомого участка ДНК, он и назвал полимеразной цепной реакцией. И в скором времени он стал одним из наиболее совершенных среди других методов молекулярно-биологических исследований.
Методы молекулярной паразитологии имеют наибольшие возможности в случае с трансмиссивными паразитозами: малярией, лейшманиозами и дирофиляриозом. Это связано с тем, что ПЦР может использоваться не только как диагностический инструмент, но и для поиска генетических различий между штаммами (в случае малярии), видами (лейшманиозы), а также для обнаружения паразитов в переносчике (дирофиляриозы). В ряде исследований ПЦР используется как предварительный метод перед применением прямого секвенирования или других молекулярно-генетических методов.
Наиболее перспективной модификацией метода ПЦР является постановка ПЦР в реальном времени. Данная методика лишена основного недостатка ПЦР-диагностики - возможности контаминации лаборатории, оборудования и реагентов продуктами реакции. Это стало возможно, поскольку при применении этого метода нет необходимости открывать пробирку с продуктом ПЦР. Детекция результатов проходит непосредственно внутри термоциклера, что позволяет проводить ПЦР без самой "грязной" стадии - электрофореза. Благодаря этому значительно уменьшилось время, требуемое для получения реакции.
Применение ПЦР при диагностике малярии и лейшманиозов имеет особую ценность в условиях референс-центров, так как дает возможность накопления значительного числа препаратов, присланных на контроль [3]. При применении ПЦР в референс-центре используется методика выделения ДНК паразита из препаратов крови "толстая капля", ранее окрашенных по Романовскому-Гимзе. Данная методика была разработана в НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского [4].
В последние годы дирофиляриоз все чаще регистрируют в центральных и северных областях России, это единственный из филяриозов, способный распространяться в умеренном климате. До 2005 г., когда случаи дирофиляриоза были выявлены более чем у 200 жителей 28 эндемичных территорий, его рассматривали как вновь возникающую паразитарную болезнь.
Как правило, диагностическое исследование проводят уже после появления клинических признаков дирофиляриоза у теплокровных - людей и собак, поэтому меры борьбы и профилактики неизменно запаздывают.
Молекулярно-биологические методы обнаружения возбудителя в организме переносчика позволяют получить данные об общей распространенности, плотности распределения инвазии, сезонности, а также оценить вероятность заражения человека дирофиляриозом в тот или иной период теплого времени года. С 2009 г. исследования подобного рода начали активно проводить за рубежом, в местах, неблагополучных по дирофиляриозу и граничащих с эндемичными районами. Внедрение в практику молекулярно-биологических методов исследования переносчиков может способствовать получению новых данных о распространенности этой патологии, а в частных случаях облегчить ее диагностику.
Еще одним перспективным направлением применения методов молекулярной паразитологии является детекция возбудителей кишечных протозоозов в клиническом материале и объектах окружающей среды. В первую очередь это касается возбудителя бластоцистоза, многообразие морфологических форм которого затрудняет постановку дифференциального диагноза. Методом верификации диагноза бластоцистоза может служить ПЦР - ее высокая чувствительность позволяет обнаружить в исследуемом материале специфический фрагмент ДНК микроорганизма, являющегося маркером данного возбудителя [11, 12].
В зарубежной литературе в последние годы появляются данные о сравнительных исследованиях культурального метода, микроскопического исследования нативного мазка и ПЦР [6]. С помощью ПЦР возможно проведение генотипирования Blastocystis spp., что необходимо для определения степени патогенности этих простейших при эпидемиологических исследованиях, рода того или иного штамма возбудителя в развитии хронического или острого течения болезни.
Ограничения применения ПЦР при рутинной диагностике паразитозов связаны со сложным жизненным циклом паразитов: когда паразит на разных стадиях жизненного цикла изменяет свою локализацию в организме хозяина, невозможно определить, какой материал оптимально пригоден для исследования. Так, применение ПЦР-диагно с ти ки у больных геогельминтозами нецелесообразно, поскольку микроскопия дает достаточно быстрый видоспецифи ческий результат. Однако применение ПЦР при геогельминтозах возможно при проведении санитарнопаразитологических исследований. В этом случае постановка ПЦР позволяет значительно сократить трудозатраты. Маловероятно также обнаружение паразита T. gondii в крови пациентов. В случае отрицательного результата ПЦР больного с подозрением на токсоплазмоз следует направлять на исследование методом иммуноферментного анализа (ИФА). При этом данные ПЦР, для которой в качестве источника ДНК используют амниотическую жидкость пациента, достаточно достоверны, что связано с наличием в ней большого числа паразитов.
Широкое внедрение ПЦР в клиническую лабораторную диагностику требует повышения уровня информированности медицинских работников о теоретических основах и возможностях современных методических подходов и интерпретации результатов анализа.
Значительное сокращение трудозатрат при постановке ПЦР по сравнению с другими методами достигается только при массовых обследованиях, так как время, необходимое для постановки 1 или 50 проб, отличается не более чем на 10%. Еще более значительного сокращения трудозатрат удается добиться при применении ПЦР в реальном времени, поскольку при применении этого метода отсутствует стадия электрофореза, а длительность ПЦР сокращена до 1,5 ч [5].
С учетом специфики паразитарных болезней можно выделить следующие перспективные направления применения молекулярно-генетических методов в паразитологии:
▪ рутинная диагностика токсоплазмоза у беременных;
▪ исследование переносчика дирофиляриоза на наличие микрофилярий (используется в эпидемиологических и научных исследованиях);
▪ поиск внутривидовых различий малярийных паразитов, связанных с лекарственной устойчивостью малярийных паразитов, а также с длительностью инкубационного периода и возможностью возникновения рецидивов (используется в эпидемиологических и научных исследованиях);
▪ рутинная диагностика малярии, лейшманиозов, трипаносомозов и бабезиоза, особенно в сложных случаях с низкой паразитемией;
▪ ретроспективный анализ препаратов на малярию и лейшманиозы с применением разработанной в НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского методики выделения ДНК малярийного паразита из окрашенных препаратов крови (используется только в референс-лабораториях);
▪ выявление простейших кишечника (криптоспоридии, лямблии, бластоцисты, дизентерийные амебы) в клиническом материале и водных объектах окружающей среды;
▪ дифференциальная диагностика диарей неясной этиологии при подозрении на паразитарную патологию.
Таким образом, молекулярно-биологические методы имеют значительные перспективы в паразитологии как в научных исследованиях, так и в практическом здравоохранении.
Литература
1. Ежов М. Н., Званцов А. Б., Сергиев В. П. Возврат малярии в страны европейского региона ВОЗ: уроки истории и современная ситуация в Закавказье и Турции // Мед. паразитол. - 2004. - № 4. - С. 16-18.
2. Ежов М. Н., Званцов А. Б., Сергиев В. П. Возврат малярии в страны европейского региона ВОЗ: уроки истории и современная ситуация. Сообщение 2. Средняя Азия // Мед. паразитол. - 2005. - № 1. - С. 26-28.
3. Жиренкина Е. Н., Понировский Е. Н., Стрелкова М. В. и др. Особенности эпидемиологии висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана, выявленные при обследовании детей методом ПЦР // Мед. паразитол. - 2011. - № 3. - С. 37-41.
4. Иванова Н. В., Морозов Е. Н., Кукина И. В. и др. Последовательность ITS 1, 5,8S и ITS 2 рДНК А-типа Plasmodium vivax и разработка метода ретроспективной ПЦР-диагностики малярии по окрашенным препаратам крови "толстая капля" // Молекул. биол. - 2001. - Т. 35, № 3. - С. 515-525.
5. ПЦР в реальном времени / Под ред. Д. В. Ребрикова. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.
6. Сергиев В. П., Успенский А. В., Романенко Н. А. и др. Новые и возвращающиеся гельминтозы как потенциальный фактор социально эпидемических осложнений в России // Мед. паразитол. - 2005. - № 4. - С. 6-8.
7. Сергиев В. П., Малышев Н. А., Дрынов И. Д. Значение паразитарных болезней в патологии человека. // Эпидемиология и инфекц. бол. - 1999. - № 4. - С. 4-6.
8. Сергиев В. П., Малышев Н. А., Дрынов И. Д. Человек и паразиты: пример сочетанной эволюции // Вестн. РАМН. - 2000. - № 11. - С. 15-17.
9. Сергиев В. П., Лебедева М. Н. Распространенность паразитарных болезней и их профилактика в России // Мед. паразитол. - 1997. - № 4. - С. 48-52.
10. Сергиев В. П., Пальцев М. А. Физиология паразитизма и проблема биологической безопасности. - М.: Медицина, 2008. - 143 с.
11. Detection of Blastocystis hominis in unpreserved stool specimens by using polymerase chain reaction / R. Stensvold, A. Brillowska-Dabrowska, H. V. Nielsen et аl. // J. Parasitol. - 2006. - Vol. 92, N 5. - P. 1081-1087.
12. Direct characterization of Blastocystis from faeces by PCR and evidence of zoonotic potential / U. Parkar, R. J. Traub, S. Kumaret et аl. // Parasitology. - 2007. - Vol. 134, N 3. - P. 359-367.