Мониторинг состава микробиома кишечника при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток: применение в клинической практике

Резюме

В настоящем исследовании в условиях реальной клинической практики изучен состав кишечного микробиома у пациентов при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. В опубликованный этап работы включены 12 взрослых пациентов, перенесших аллогенную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Методами графического и математического анализа выявлены закономерности изменения состава кишечного микробиома при ТГСК, что связано с обширной антибактериальной терапией и химиотерапией на протяжении госпитализации. Независимое от других клинико-лабораторных параметров снижение альфа-биоразнообразия кишечного микробиома подтверждено в мультивариантной математической модели. Полученные данные позволяют внедрить мониторинг состава микробиома как механизм стратификации пациентов при выполнении ТГСК в отношении рисков инфекционных осложнений и других неблагоприятных исходов трансплантации.

Ключевые слова:микробиом; трансплантация; гемопоэтические стволовые клетки

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Стома И.О., Усс М.А.; сбор и обработка материала - Усс М.А., Миланович Н.Ф., Губанова Т.Н., Модулева Е.А., Стома В.О.; статистическая обработка - Стома В.О.; написание текста - Стома И.О., Усс М.А., Губанова Т.Н.; редактирование - Стома И.О.

Для цитирования: Стома И.О., Усс М.А., Миланович Н.Ф., Стома В.О., Губанова Т.Н., Модулева Е.А. Мониторинг состава микробиома кишечника при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток: применение в клинической практике // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2022. Т. 11, № 2. С. 85-90. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2022-11-2-85-90

На протяжении последних двух десятилетий микробное сообщество, т.е. микробиом человека, был признан фундаментальным фактором, определяющим физиологию и патологию хозяина. Доказаны изменения спектра и характеристик микробиома в ряде инфекционных и неинфекционных заболеваний человека [1], а современные исследования вышли далеко за пределы классического понимания роли микроорганизмов в нормальной и патологической физиологии человека. Активное изучение микробиома кишечника началось с момента публикации "Наш другой геном" в журнале Nature [2], а внедрение в исследовательскую практику метода 16s рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) секвенирования позволило идентифицировать различные бактерии и таксономический состав кишечного микробиома. Плотность микробиома кишечника в норме варьирует от 1013 до 1014 кл/г фекального материала более чем с 1000 видами бактерий [3]. Несмотря на значительное разнообразие видов микроорганизмов в составе микробиоты, большинство представителей принадлежит только к 4 типам в современной биологической систематике: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria [3]. Типы Firmicutes и Bacteroidetes составляют более 90% бактериальной популяции в толстой кишке, где плотность микробиоты наибольшая [3]. При этом представители типов Actinobacteria и Proteobacteria практически всегда присутствуют в составе микробиоты в относительно невысоком количестве, последние обычно составляют до 1% [4].

Одна из наиболее изученных ролей микроорганизмов человека заключается в обеспечении защиты от бактериальных патогенов. Это особенно важно в условиях стационаров, чтобы предотвратить инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, вызываемые бактериями, происходящими из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Комменсальные представители микробиома способны исключить данные высокоустойчивые патогены из состава микробного сообщества ЖКТ, а также противостоять колонизации de novo. Ранее были подробно обозначены методы и направления изучения микробиома в современной клинической медицине [1]. Дифференцированный микробиом и его роль в защите от инфекционных заболеваний особенно важны у пациентов с ослабленным иммунитетом. Известно, что наибольшая глубина и длительность поражения иммунной системы, а также восприимчивость к инфекционным агентам отмечаются у пациентов при выполнении трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (как периферических, так и костного мозга) [5]. Современные показания к трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) включают следующие заболевания: острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, неходжкинские лимфомы, лимфому Ходжкина, множественную миелому. На модели иммуносупрессии при ТГСК получены многие основополагающие данные о микробиоме человека, обозначенные в первой русскоязычной монографии "Микробиом человека" [6]. Важно отметить, что вопрос биоразнообразия микробиома имеет несомненное клиническое значение, ведь на большой когорте трансплантационных пациентов был показан независимый эффект разнообразия микробиома на риск трансплант-ассоциированной летальности в течение нескольких лет после аллогенной ТГСК [7]. Биоразнообразие отражает количество различных видов/операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий в микробиоме.

Альфа-разнообразие - это множество разных видов в пределах биологического образца, что определяется индексами Чао 1, Шеннона, Симпсона. Бета-разнообразие - разнообразие видов между двумя биологическими образцами. Индекс Чао 1 - мера наблюдаемого/скрытого разнообразия; индекс Шеннона - мера разнообразия и плавности микробиома, где более высокий индекс соответствует большему разнообразию; индекс Симпсона - мера доминирования вида в образце [8]. Ранее были доказаны таксономические ассоциации доминирования отдельных типов в микробиоме и развитии инфекций кровотока, что является верным как для грамотрицательных бактерий [4], так и для отдельных грамположительных микроорганизмов [9]. Более того, индекс биоразнообразия до процедуры проведения ТГСК был положительным прогностическим фактором успеха трансплантации [10].

Цель исследования - оценка параметров биоразнообразия кишечного микробиома и клинико-лабораторных данных в динамике у пациентов при выполнении ТГСК.

Материал и методы

За 2019-2021 гг. в протокол сбора и низкотемпературного замораживания образцов стула были включены взрослые пациенты (в возрасте 24-47 лет; медиана 34 года; интерквартильный интервал IQR 30 лет - 43 года; 50% женщин), госпитализированные для выполнения ТГСК на базе ГУ "Минский научно-практический центр хирургии, трансплантологии и гематологии" (Республика Беларусь). Протокол исследования был утвержден этической комиссией учреждения (протокол № 10, 2019). Исследование было зарегистрировано в международном реестре клинических исследований (идентификационный номер NCT04281797). Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, а также критериями STROBE для обсервационных исследований. Финансирование исследования проводил Государственный комитет по науке и технологиям Республики Беларусь за счет средств государственной программы "Наукоемкие технологии и техника" на 2016- 2020 гг. (раздел "Медицинские биотехнологии"), номер государственной регистрации 20200047 от 16.01.2020, а также при финансовой поддержке ГУ "Минский научно-практический центр хирургии, трансплантологии и гематологии".

Критерии включения в данное клиническое исследование: наличие ≥2 последовательных высококачественных секвенированных биологических образцов у одного пациента. Одним из условий был отбор первого образца до начала процедуры ТГСК, чтобы иметь базовую точку сравнения для каждого из участников. 2 других образца отбирали в ранний посттрансплантационный период, до 30 сут после ТГСК. Клинические и лабораторные данные (показатели общего, биохимического исследования крови, 3-часовой термометрии, данные клинического наблюдения, исследования прокальцитонина, маркеров грибковых инфекций, серологические маркеры инфекций, микробиологические посевы эпитопов и стерильных жидкостей организма, ультразвуковые и рентгенологические исследования) собирали у каждого из пациентов проспективно в рамках реальной клинической практики. Критериями реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) были приняты определения NCCN v. 1.2021 [11]. Автоматические бактериологические системы "VITEK" (Biomerieux, Франция) в комбинации с MALDI-TOF масс-спектрометрией применяли для экспресс-идентификации патогенов. Среди клинических параметров в анализ были включены возраст, пол пациентов, основное заболевание, режим кондиционирования, источник гемопоэтических стволовых клеток, время, продолжительность и выбор антибиотиков, цитостатиков, характеристики трансплантации. Медиана наблюдения пациентов в исследовании составила 6 мес.

Технические и лабораторные процедуры. После экстракции и очищения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в каждом из биологических образцов, выполняли ПЦР-амплификацию V3-V4 региона гена 16SS рРНК с помощью модифицированных универсальных бактериальных праймеров (Illumina, США). После индексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) каждой из ДНК был присвоен уникальный индекс, позволяющий идентифицировать ампликоны одного образца. В зависимости от потребностей покрытия можно было объединить до 96 образцов. Выделение тотальной ДНК из образцов стула проводили с помощью наборов QIAamp® PowerFecal® DNA Kit (Qiagen, Нидерланды) на автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот QIAcube (Qiagen, Нидерланды). Дальнейшую обработку образцов ДНК для приготовления 16S метагеномной библиотеки проводили в соответствии с инструкцией "16S Metagenomic Sequencing Library Preparation" от Illumina. Секвенирование подготовленной метагеномной библиотеки проводили на платформе MiSeq Illumina с использованием реагентов для секвенирования MiSeq v3 (600 циклов). Далее детально описаны лабораторные этапы исследования.

Выделение тотальной ДНК из образцов стула проводили на автоматической станции QIAcube с использованием набора реагентов QIAamp PowerFecal DNA Kit по протоколу IRT. Выделенную ДНК хранили при -20 °C. Измерение концентрации ДНК в образцах проводили на флюориметре Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США) при помощи набора реагентов 1X dsDNA HS Assay Kit (100 исследований). Для консервативных V3-V4 участков гена 16S рРНК бактерий использовали рекомендованные Illumina последовательности праймеров. Для наработки целевой ДНК полученную в результате выделения ДНК разводили до концентрации 5 нг/мкл и проводили амплификацию согласно инструкции "16S Metagenomic Sequencing Library Preparation" от Illumina. С целью анализа длины ампликонов проводили электрофорез 4-5 мкл продукта ПЦР-1 в 2% агарозном геле. Очистку продукта ПЦР проводили с помощью набора Agencourt AMPure XP и магнитного штатива DynaMag-96 (Invitrogen, США) путем двойной отмывки раствором этанола 80%. Индексную ПЦР проводили с использованием набора IDT for Illumina Nextera DNA UD Indexes (96 Indexes, 96 Samples). Концентрацию ДНК рассчитывали согласно формуле, предложенной в инструкции "16S Metagenomic Sequencing Library Preparation" от Illumina.

Филогенетическую классификацию до видового уровня выполняли на оcновании байесовской модели, а также базы данных рибосомальной РНК SILVA [12]. Сиквенс-последовательности группировали в ОТЕ на основании 97% идентичности. Общее количество генов 16S рРНК в расчете на 1 г биологического материала, т.е. меру бактериальной плотности, рассчитывали с помощью количественной ПЦР исходя из общего количества ДНК, выделенного из каждого образца. Индексы биоразнообразия, использованные в работе, включали индексы Шеннона, Симпсона, Чао 1 и обратный индекс Симпсона. Обработку и анализ массива клинических, лабораторных и филогенетических данных выполняли с помощью программного кода. Код был создан авторами применительно к данному исследованию на языке программирования R, в свободной программной среде вычислений с открытым исходным кодом в рамках проекта GNU (R Development Core Team, Vienna, Austria).

Статистические методы. Для оценки независимого характера различий в биоразнообразии микробиома на фоне процедуры ТГСК применяли байесовские непараметрические статистические методы, включая распределение Дирихле Dir (α), семейство непрерывных многомерных вероятностных распределений. UniFrac применяли как показатель расстояния, используемый для сравнения биологических сообществ. В качестве меры несходства был принят индекс Брея-Кертиса, используемый для количественной оценки композиционного несходства между двумя различными участками на основе подсчетов на каждом участке. Теоретической основой анализа в исследовании была принята байесовская модель.

Результаты и обсуждение

В пилотный этап исследования были включены 12 пациентов. У каждого было собрано не менее 2 образцов для исследования. В таблице представлены базовые клинические и демографические характеристики пациентов в исследовании.

Основные характеристики пациентов в трансплантационном периоде (n=12)

Примечание. РТПХ - реакция "трансплантат против хозяина"; МТХ (Metotrexat) - метотрексат; ММФ - микофенолата мофетил; ГКС - глюкокортикостероиды.

Таким образом, острый лейкоз был наиболее распространенным показанием к выполнению трансплантации, в основном без минимальной остаточной болезни (МОБ; 6 из 8 больных). Использовали режимы кондиционирования, как миелоаблативные, так и режимы сниженной токсичности (преимущественно 10 из 12 случаев). Основным источником ГСК являлась периферическая кровь (в 11 из 12 случаев) от родственного (3 случая) и неродственного доноров (9 случаев). Преимущественно (в 7 случаях) трансплантация выполнялась пациентам в первой ремиссии. Ex vivo деплеция не применялась, однако при трансплантации от полностью совместимого неродственного донора использовали методику in vivo деплеции антитимоцитарным глобулином, а при частично совместимой трансплантации in vivo - деплецию посттрансплантационным циклофосфаном. Исходные характеристики биоразнообразия кишечного микробиома до процедуры ТГСК представлены на рис. 1.

Рис. 1. Исходное альфа-биоразнообразие (индекс Шеннона) кишечного микробиома в зависимости от пола и возраста пациентов перед процедурой трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

Таким образом, мы видим, что наиболее высокие показатели разнообразия до ТГСК были отмечены у молодых женщин в возрасте около 30 лет. При эксплоративном анализе потенциальных факторов, влияющих на биоразнообразие микробиома, данных за существенные различия в зависимости от основной нозологии показано не было. Несомненно, важной задачей исследования было изучение того, как меняется биоразнообразие кишечного микробиома в динамике при проведении процедуры ТГСК. При графическом анализе внимание привлекло значительное снижение уровня альфа-биоразнообразия во 2-м и 3-м образцах в сравнении с исходным уровнем (рис. 2).

Рис. 2. Биоразнообразие образцов кишечного микробиома при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в динамике в зависимости от номера образца

Для математического подтверждения наблюдаемого графически феномена, заключающегося в том, что при процедуре ТГСК существенно снижается альфа-биоразнообразие кишечного микробиома, была использована байесовская непараметрическая модель Дирихле. Проверку нулевой гипотезы проводили путем исследования различий в среднем распределении каждого таксона по группам с учетом избыточной дисперсии. Авторы описывают этот тест как непараметрический аналог t-критерия для 2 выборок, но при этом оценивается, равны ли частоты таксонов, наблюдаемые в обеих группах метагеномных образцов (нулевая гипотеза). В настоящей работе проводили анализ на таксономических типах, но он может быть выполнен на любом таксономическом уровне, включая ОТЕ. По результатам анализа было доказано, что альфа-биоразнообразие кишечного микробиома во 2/3-м образцах у пациентов при ТГСК достоверно и независимо ниже, чем до ТГСК, в 1-м образце (Xdc=72,93; p<0,001).

При более глубоком анализе динамики состава микробиома стоит отметить, что, помимо снижения биоразнообразия, у части пациентов (3 пациента) происходит практически полное замещение микробиома одним таксономическим типом. Ранее Y. Taur и соавт. данный феномен обозначили как доминирование (замещение более 30% относительной плотности микробиома одним таксономическим типом) [13]. Более того, в отношении энтерококков это являлось независимым фактором риска энтерококковых инфекций.

Позже группой под руководством I. Stoma было доказано, что доминирование типа Proteobacteria в микробиоме кишечника является независимым фактором развития грамотрицательных инфекций кровотока [4]. В рамках настоящего пилотного этапа исследования также обращено внимание на то, что в сравнении с микробиомом до ТГСК у ряда пациентов как раз и происходит нарастание относительной плотности типа Proteobacteria (5 образцов во второй группе и 5 образцов в третьей группе). Учитывая, что в нормальном микробиоме относительная плотность Proteobacteria, как правило, составляет до 1%, данные изменения можно назвать прогностически неблагоприятными. Более того, у 1 пациента в настоящем исследовании после ТГСК развился эпизод доминирования типа Proteobacteria, что стоит рассматривать как фактор предикции грамотрицательной инфекции и корректировать эмпирическую антибактериальную терапию с учетом этих данных. Интересно также отметить, что при снижении абсолютного содержания типа Bacteroidetes в микробиоме на протяжении ТГСК также снижалось и биоразнообразие внутри всего данного типа.

Заключение

Итак, в настоящем проспективном исследовании была выполнена динамическая оценка альфа-биоразнообразия кишечного микробиома в выборке взрослых пациентов при выполнении процедуры ТГСК. Графический и математический анализ сиквенс-данных в комплексе с клинико-лабораторными переменными позволил доказать, что альфа-биоразнообразие микробиома существенно и достоверно снижается при ТГСК в сравнении с базовым уровнем (Xdc 72,93; p<0,001; мультивариантный анализ распределения Дирихле). Ранее в литературе было обозначено, что пациенты с изначально более низким уровнем биоразнобразия кишечного микробиома перед ТГСК отличаются более высоким уровнем 3-летней посттрансплантационной летальности [7, 10] с учетом прочих переменных. В выполненном исследовании, помимо снижения биоразнообразия, показана динамика соотношения основных таксономических типов в микробиоме на протяжении процедуры ТГСК и раннего пострансплантационного периода, а именно снижение относительной плотности представителей типа Bacteroidetes, c нарастанием представителей типа Proteobacteria. В одном из клинических случаев в исследовании уровень типа Proteobacteria после ТГСК достиг доминирования, т.е. более 30%, что, по ранее опубликованным данным, является предиктором инфекций кровотока. Настораживает также то, что именно среди типа Proteobacteria, по данным мирового мониторинга [14], встречается наибольшее количество проблемных микроорганизмов с высокой распространенностью генов множественной устойчивости к антибиотикам. Немаловажным является то, что нами на практике отработана методология мониторинга и оценки показателей биоразнообразия микробиома на протяжении процедуры ТГСК, что в перспективе позволит выделять и стратифицировать группы риска по инфекционным процессам, РТПХ и даже посттрансплантационной летальности.

Благодарность. Коллектив авторов выражает благодарность кандидату химических наук, доценту кафедры биоорганической химии УО "Белорусский государственный медицинский университет" А.С. Бабенко за научно-техническую и организационную помощь в проведении исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Стома И.О. Микробиом в медицине : руководство для врачей. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2020. 320 c.

2. Zhao L. The tale of our other genome // Nature. 2010. Vol. 465, N 7300. P. 879-880.

3. Sender R., Fuchs S., Milo R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body // PLoS Biol. 2016. Vol. 14. Article ID e1002533.

4. Stoma I., Littmann E.R., Peled J.U., Giralt S., van den Brink M.R.M., Pamer E.G. et al. Compositional flux within the intestinal microbiota and risk for bloodstream infection with gram-negative bacteria // Clin. Infect. Dis. 2021. Vol. 73, N 11. P. e4627-e4635. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciaa068

5. Sahin U., Toprak S.K., Atilla P.A., Atilla E, Demirer T. An overview of infectious complications after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation // J. Infect. Chemother. 2016. Vol. 22, N 8. P. 505-514.

6. Стома И.О., Карпов И.А. Микробиом человека. Минск : ДокторДизайн, 2018: 122 c.

7. Taur Y., Jenq R.R., Perales M.A., Littmann E.R., Morjaria S., Ling L. et al. The effects of intestinal tract bacterial diversity on mortality following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation // Blood. 2014. Vol. 124, N 7. P. 1174-1182. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2014-02-554725

8. Morgan X.C., Segata N., Huttenhower C. Biodiversity and functional genomics in the human microbiome // Trends Genet. 2013. Vol. 29, N 1. P. 51-58.

9. Ubeda C., Taur Y., Jenq R.R., Equinda M.J., Son T., Samstein M. et al. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans // J. Clin. Invest. 2010. Vol. 120, N 12. P. 4332-4341. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI43918

10. Taur Y., Jenq R.R., Ubeda C., van den Brink M., Pamer E.G. Role of intestinal microbiota in transplantation outcomes // Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2015. Vol. 28, N 2-3. P. 155-161. DOI: https://doi.org/10.1016/j.beha.2015.10.013

11. Treatment by Cancer Type [Electronic resource]. NCCN. URL: https://www.nccn.org/guidelines/category_1 (дата обращения: 04.09.2021)

12. Yilmaz P., Parfrey L.W., Yarza P., Gerken J., Pruesse E., Quast C. et al. The SILVA and “All-species Living Tree Project (LTP)” taxonomic frameworks // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42. P. D643-D648. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkt1209

13. Taur Y., Xavier J.B., Lipuma L., Ubeda C., Goldberg J., Gobourne A. et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation // Clin. Infect. Dis. 2012. Vol. 55, N 7. P. 905-914. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/cis580

14. ResistanceMap [Electronic resource]. URL: https://resistancemap.cddep.org/ (дата обращения: 04.09.2021)

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Ющук Николай Дмитриевич
Академик РАН, профессор, почетный заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, президент ФГБОУ ВО "Московский государст­венный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России, член Правления Национального научного общества инфекционистов.
Вскрытие
Медицина сегодня
II Всероссийская конференция с международным участием "Воспаление глаза" 12 ноября 2022 года, Москва

II Всероссийская конференция с международным участием "Воспаление глаза" 12 ноября 2022 года, Москва Воспалительные заболевания глаза - широко распространенная и многогранная проблема, с которой может столкнуться в своей практике любой специалист. Найти оптимальные алгоритмы...

"Интегративная дерматовенерология и косметология. Новые стандарты взаимодействия"

Масштабное событие в области дерматовенерологии и косметологии - II конференция InteDeCo 2022 "Интегративная дерматовенерология и косметология. Новые стандарты взаимодействия" - состоится 16-17 декабря 2022 года. Программа мероприятия пройдет на современной...

VIII Московский Городской Съезд педиатров с межрегиональным и международным участием "Трудный диагноз в педиатрии"

VIII Московский Городской Съезд педиатров с межрегиональным и международным участием "Трудный диагноз в педиатрии" Приглашаем педиатров, детских эндокринологов, реаниматологов, гинекологов, неонатологов, кардиологов, хирургов, урологов, психологов, специалистов по лучевой...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»