Определение антител к вирусу SARS-СoV-2 у пациентов с новой коронавирусной инфекцией

Резюме

COVID-19, вызванный новым вирусом SARS-CoV-2, создает серьезные проблемы для глобального общественного здравоохранения. Обнаружение антител в сыворотке крови является одним из важных методов диагностики пациентов с COVID-19.

Цель исследования - изучение динамики появления вируснейтрализующих антител и антител к белкам вируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19.

Материал и методы. Исследовали сыворотки крови 4 групп людей: интактных доноров (сыворотки крови взяты в 2016-2019 гг.), больных с лабораторно подтвержденным диагнозом "острая респираторная вирусная инфекция", больных гриппом (выявлены антитела к вирусу гриппа) и пациентов с подтвержденным методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) диагнозом "COVID-19". Сыворотки крови исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов для определения IgG к белкам SARS-CoV-2 (N, S), суммарных антител к рецептор-связывающему домену (RBD) белка S и с помощью реакции нейтрализации (РН).

Результаты и обсуждение. В парных сыворотках крови людей из 1-3-й групп методом ИФА и при постановке РН антитела к SARS-CoV-2 не выявлены. На момент госпитализации пациентов с COVID-19 в сыворотках крови 12 (19%) больных антитела к SARS-CoV-2 при их определении методами РН и ИФА отсутствовали. В сыворотках крови, взятых спустя 4-9 сут после госпитализации, выявлены вируснейтрализующие антитела и антитела хотя бы к 1 белку вируса в ИФА.

Заключение. На момент госпитализации у подавляющего числа больных был сформирован иммунный ответ к вирусу SARS-CoV-2. В динамике наблюдения уровни антител к белкам SARS-CoV-2 повышались, в большей степени к RBD.

Ключевые слова:COVID-19; антитела к белкам SARS-CoV-2; вируснейтрализующие антитела к SARS-CoV-2

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания № АААА-А20-120081790043-5.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Игнатьев Г.М., Ишмухаметов А.А., Максимов Н.Л., Артемов Е.К., Лиознов Д.А.; сбор материала - Алешенко Н.Л., Даниленко Д.М., Клотченко С.А.; обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста статьи - Козловская Л.И., Мефед К.М., Волок В.П., Пиняева А.Н.; редактирование - Белялетдинова И.Х., Еровиченков А.А.; утверждение окончательного варианта статьи - Игнатьев Г.М., Ишмухаметов А.А.; ответственность за целостность всех частей статьи - Козловская Л.И., Игнатьев Г.М.

Для цитирования: Игнатьев Г.М., Козловская Л.И., Мефед К.М., Волок В.П., Белялетдинова И.Х., Еровиченков А.А., Даниленко Д.М., Алешенко Н.Л., Клотченко С.А., Максимов Н.Л., Артемов Е.К., Пиняева А.Н., Лиознов Д.А., Ишмухаметов А.А. Определение антител к вирусу SARS-CoV-2 у пациентов с новой коронавирусной инфекцией // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2022. Т. 11, № 1. С. 21-27. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2022-11-1-21-27

Первые случаи новой коронавирусной инфекции (COVID-19) были зарегистрированы в конце 2019 г. [1]. Этиологический агент был идентифицирован как β-коронавирус, генетически был сходен с возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) и, таким образом, был назван SARS-CoV-2 [2]. Из-за быстрого роста числа случаев и широкого неконтролируемого распространения по всему миру Всемирная организация здравоохранения объявила пандемию COVID-19 [3]. Быстрое выявление этиологического агента, информации о генетической последовательности вируса и свободный доступ к ней привели к скорой доступности диагностических тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в реальном времени [4]. Молекулярно-генетическая диагностика позволяет провести лабораторное подтверждение заболевания, в то же время серологические исследования позволяют провести эпидемиологическое расследование, дифференцировать случаи бессимптомного течения, изучить тяжесть заболевания и механизмы формирования гуморального противовирусного иммунитета. Эти исследования также важны и необходимы для оценки результатов испытаний вакцинных препаратов.

Вирион SARS-CoV-2 оболочечный, он содержит 4 структурных белка: многодоменный гликопротеин шипика (spike) S; нуклеопротеин N, ассоциированный с РНК-геномом вируса; мембранный белок М и малый оболочечный белок Е - встроенные в липидную оболочку. Белок S определяет первые этапы репликативного цикла вируса: взаимодействие с рецептором АСЕ2 (субъединица S1 через рецептор-связывающий домен RBD), слияние мембран вириона и клетки (субъединица S2) и проникновение нуклеокапсида в цитоплазму. Белки S и N являются основными иммуногенами [4, 5].

Цель исследования - изучение динамики появления вируснейтрализующих антител (ВНА) и антител к белкам вируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19.

Материал и методы

На антитела к N- и S-белкам вируса SARS-CoV-2 проведено тестирование 189 сывороток крови 4 разных групп людей. В 1-ю группу включено 30 сывороток, собранных в 2016 и 2017 гг. от людей в возрасте 20-60 лет в рамках Национальной программы серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики. Во 2-ю группу - 23 сыворотки, полученные до мая 2019 г. от больных с лабораторно подтвержденным диагнозом "острая респираторная вирусная инфекция" (ОРВИ). Из них возбудителями инфекции в 3 случаях был респираторно-синцитиальный вирус; в 12 - риновирусы; в 1 - аденовирус; в 2 - метапневмовирус; вирусы парагриппа - в 2 случаях (1-го и 4-го типа); коронавирусы (сезонные) - 3, из них 2 - Е229, 1 - ОС43. Лабораторное выявление этиологического агента ОРВИ проводили на клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов амплификации с использованием "АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL" (кат. номер R-V57). В 3-ю группу включено 10 сывороток, отобранных у вакцинированных людей, содержащих антитела к вирусу гриппа по результатам реакции торможения гемагглютинации со штаммами вируса гриппа типа А (H1N1, H3N2) и типа В (штаммы линий Виктория и Ямагата). В 4-ю группу - 126 сывороток от 63 пациентов с диагнозом "новая коронавирусная инфекция COVID-19". Все больные находились в условиях стационарного лечения. У всех больных был хотя бы 1 положительный результат ПЦР с детекцией в реальном времени, полученный из носоглоточных смывов. Диагноз "новая коронавирусная инфекция COVID-19" был подтвержден результатами компьютерной томографии.

Сыворотки крови были получены от больных в динамике лечения: 1-я сыворотка - на 1-2-е сутки после госпитализации, 2-я сыворотка - через 4-9 сут после получения первой (интервал между отбором сывороток составил 6,11±0,10 дня). В исследовании использовали парные сыворотки.

Для участия в исследовании получено письменное информированное согласие от всех субъектов или их законных представителей в клинических учреждениях, в которых проводили сбор и первичную обработку сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили с использованием коммерческих наборов для определения IgG к белкам SARS-CoV-2: нуклеокапсида N и спайка S (ООО НПФ "Литех"), а также суммарных антител к RBD (ООО "Биопалитра"), согласно инструкциям производителей. Результаты ИФА представляли в виде индекса антител, рассчитанного согласно инструкциям производителей.

Авидность антител определяли, как описано ранее [9, 10].

Для проведения реакции нейтрализации (РН) использовали штамм ПИК35 SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428852), выделенный из назофарингеального мазка больного СOVID-19. Штамм прошел 4 последовательных пассажа в культуре клеток Vero. Штамм вызывал цитопатическое поражение клеток.

Для проведения РН использовали 2-кратные разведения сыворотки крови, смешивали их с вирусом в дозе 50-200 ТЦД501 в соотношении 1 : 1 для получения серии из 8 разведений, начиная с 1 : 8.

1 ТЦД50 - тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% тест-объектов. - Прим. ред.

Сыворотки крови с внесенным штаммом вируса инкубировали в течение 1 ч при 37 °С, после чего 100 мкл смеси добавляли к монослою клеток Vero в 2 параллелях.

Контроль: титрование положительной и отрицательной референс-сывороток, а также титрование вносимой дозы вируса. Цитопатическое действие вируса оценивали визуально на 5-е сутки после заражения. Расчет титра антител проводили по формуле Кербера [11]. Сыворотки крови, которые в разведении 1 : 8 не вызывали нейтрализацию вируса, считали отрицательными.

Статистическая обработка: рассчитаны экстенсивные показатели, средние логарифмические значения индексов в ИФА, для реакции нейтрализации - средние геометрические титры (СГТ для РН) и их стандартные отклонения с использованием программы OriginPro 8 (OriginLab Corporation, USA).

Результаты и обсуждение

При проведении ИФА сывороток крови из 1-3-й групп антитела к белкам N, S и RBD вируса SARS-CoV-2 не выявлены. Сыворотки крови пациентов 1-3-й групп в РН со штаммом ПИК35 SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428852) также показали отрицательные результаты (титр антител ниже порога определения, <1 : 8). Изученные сыворотки крови были отрицательными как в РН, так и в ИФА, что свидетельствует о специфичности тестов, используемых для определения антител к белкам вируса SARS-CoV-2.

Результаты тестирования сывороток крови на антитела к различным структурам SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19 представлены в таблице.

Результаты тестирования сывороток крови на антитела к SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19

Примечание. IgG N - антитела класса IgG к белку N; IgG S - антитела класса IgG к белку S; АТ RBD - суммарные антитела к рецептор-связывающему домену белка S; РН - реакция нейтрализации; ВНА - вируснейтрализующие антитела; ИФА - иммуноферментный анализ.

На момент госпитализации только у 12 (19,0%) больных антитела к SARS-CoV-2 в сыворотках крови отсутствовали. У 2 (3,2%) пациентов не выявлены антитела ни в одной из используемых тест-систем ИФА, но обнаружены ВНА. У большинства пациентов (49 человек, 77,8%) в ИФА определены антитела к белкам вируса SARS-CoV-2, в 26 сыворотках крови выявлены антитела сразу к нескольким белкам вируса. При этом 25 из этих сывороток крови обладали вируснейтрализующей активностью.

Всего из 38 первых сывороток крови, обладающих вируснейтрализующей активностью, 36 были положительными в реакции ИФА как минимум к одному из белков вируса SARS-CoV-2 (94,7% сывороток крови, положительных в РН, были положительными в ИФА). Из 36 сывороток крови положительных в ИФА и РН 28 (77,7%) были положительными в ИФА с белком RBD.

Во всех исследованных повторных сыворотках крови выявлена вируснейтрализующая активность и они были положительными хотя бы в одной из ИФА тест-систем. Следует отметить, что антитела к белку RBD выявлены во всех 63 сыворотках крови. Из них 55 сывороток были положительными в ИФА на антитела к белкам N, S и RBD, 4 - положительны на белки N и RBD, 3 - положительны к белкам S и RBD и 1 - только к RBD.

Из данных, представленных на рисунке, следует, что значения уровня антител, определенных в ИФА ко всем белкам, увеличивались в динамике наблюдения, при этом в большей степени это относится к антителам к RBD. Рассчитанный средний геометрический титр ВНА также увеличивался в динамике от 0,86±0,81 до 2,14±0,55 lg. При оценке авидности антител в первых сыворотках крови этот показатель составлял 0-11%, а во вторых - 13-31%.

Результаты выявления в динамике вируснейтрализующих антител и антител к белкам SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19

А - титры ВНА (lg) к штамму ПИК35 вируса SARS-CoV-2; B - индексы суммарных антител к белку RBD в ИФА; C - индексы антител класса IgG к белку нуклеокапсида N в ИФА; D - индексы антител класса IgG к белку S в ИФА. * - доля негативных сывороток крови на момент первого взятия указана цифрой на графике; титр негативных сывороток <1 : 8 принят равным нулю для удобства представления; точка 1 - 1-2-е сутки после госпитализации, точка 2 - 4-9-е сутки после госпитализации.

В ходе проведенного исследования было показано, что сыворотки крови людей, перенесших вирусные респираторные инфекции, а также сыворотки крови так называемых интактных доноров, полученных до декабря 2019 г., в использованных тест-системах ИФА с белками вируса SARS-CoV-2 и в РН дали отрицательный результат. Это подтверждает специфичность разработанных тест-систем и отсутствие циркуляции SARS-CoV-2 в тот период среди населения, по крайней мере среди участников 1-3-й групп исследования.

Известно, что сроки появления антител к SARS-CoV-2, определяемых в РН и в ИФА, варьируют от 2 до 11 дней [4-8]. При этом чувствительность тест-систем ИФА выше, если в качестве иммуносорбента использовали домен RBD белка S. С наличием антител к RBD SARS-CoV-2 связывают и вируснейтрализующую активность сывороток крови [4, 6]. Отмечено, что вируснейтрализующая активность сывороток крови коррелирует с тяжестью заболевания: чем тяжелее протекает COVID-19, тем выше вируснейтрализующая активность сыворотки крови больного [5-8]. Показано, что к моменту клинического подтверждения диагноза COVID-19 у больных имеются антитела (определяемые как в ИФА, так и в РН), но их активность быстро снижается [5-8].

Заключение

Длительность и сроки инкубационного периода болезни у больных, включенных в исследование, было сложно установить, но каждому из них при поступлении был выставлен диагноз COVID-19. На фоне признаков пневмонии, высокой температуры тела и сниженной сатурации (SpO2) у 77,7% больных обнаружены специфические антитела к возбудителю, определяемые в ИФА, а у 60,3% выявлены ВНА. Таким образом, на момент госпитализации у подавляющего числа больных был сформирован иммунный ответ к вирусу SARS-CoV-2. Спустя короткий период (4-9 сут) у всех больных сформировались антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью и взаимодействующие с доменом RBD белка S вируса.

Литература

1. Zhou P., Yang X.L., Wang X.G., Hu B., Zhang L., Zhang W. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin // Nature. 2020. Vol. 579, N 7798. P. 270-273. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020- 2012-7

2. Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2 // Nat. Microbiol. 2020. Vol. 5, N 4. P. 536-544. DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-020-0695-z

3. WHO Director-General’s opening remarks at the media briefing on COVID-19, 11 March 2020. World Health Organization, 11 March 2020. https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19---11-march-2020

4. Okba N.M.A., Müller M.A., Li W., Wang C. et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2-specific antibody responses in coronavirus disease patients // Emerg. Infect. Dis. 2020. Vol. 26, N 7. P. 1478-1488. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2607.200841

5. Meyer B., Drosten C., Müller M.A. Serological assays for emerging coronaviruses: challenges and pitfalls // Virus Res. 2014. Vol. 194. P. 175-183. DOI: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.03.018

6. Wu F., Wang A., Liu M., Wang Q. et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications // medRxiv. 2020.03.30.20047365. DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20047365

7. Amanat F., Stadlbauer D., Strohmeier S., Nguyen T.H.O. et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans // Nat. Med. 2020. Vol. 26, N 7. P. 1033-1036. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0913-5

8. Zhao J., Yuan Q., Wang H., Liu W. et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019 // Clin. Infect. Dis. 2020. 2020. Vol. 71, N 16. P. 2027-2034. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciaa344

9. Narita M., Yamada S., Matsuzono Y., Itakura O. et al. Immunoglobulin G avidity testing in serum and cerebrospinal fluid for analysis of measles virus infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1996. Vol. 3, N 2. P. 211-215. DOI: https://doi.org/10.1128/cdli.3.2.211-215.1996

10. Atrasheuskaya A.V., Kulak M.V., Neverov A.A., Rubin S., Ignatyev G.M. Measles cases in highly vaccinated population of Novosibirsk, Russia, 2000-2005 // Vaccine. 2008. Vol. 26, N 17. P. 2111-2118. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2008.02.028

11. Karber G. Beitrag zur kollecktiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche // Arch. Exptl. Pathol. Pharmakol. 1931. Vol. 162. P. 480-483.

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Ющук Николай Дмитриевич
Академик РАН, профессор, почетный заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, президент ФГБОУ ВО "Московский государст­венный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России, член Правления Национального научного общества инфекционистов.
Вскрытие
Медицина сегодня
Ждем вас 2-3 декабря 2022 года на Зимней школе РОРР "Визуализация в педиатрии и неонатологии"

Новые знания от ведущих экспертов на Зимней школе РОРР "Визуализация в педиатрии и неонатологии"! Современная педиатрическая практика неотделима от научного и технического прогресса, достижения которого зачастую меняют подходы к диагностике и определению лечебной тактики. В...

Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня

Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня! С 29 ноября по 1 декабря 2022 года в Москве пройдет XI Национальный конгресс "Пластическая хирургия,...

X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца"

6-7 декабря 2022 года состоится юбилейная X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца", которая будет проходить в очном и онлайн-формате в ФГБУ "НМИЦ ССХ им. А.Н. Бакулева"...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»