Определение антител к вирусу SARS-СoV-2 у пациентов с новой коронавирусной инфекцией

Резюме

COVID-19, вызванный новым вирусом SARS-CoV-2, создает серьезные проблемы для глобального общественного здравоохранения. Обнаружение антител в сыворотке крови является одним из важных методов диагностики пациентов с COVID-19.

Цель исследования - изучение динамики появления вируснейтрализующих антител и антител к белкам вируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19.

Материал и методы. Исследовали сыворотки крови 4 групп людей: интактных доноров (сыворотки крови взяты в 2016-2019 гг.), больных с лабораторно подтвержденным диагнозом "острая респираторная вирусная инфекция", больных гриппом (выявлены антитела к вирусу гриппа) и пациентов с подтвержденным методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) диагнозом "COVID-19". Сыворотки крови исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов для определения IgG к белкам SARS-CoV-2 (N, S), суммарных антител к рецептор-связывающему домену (RBD) белка S и с помощью реакции нейтрализации (РН).

Результаты и обсуждение. В парных сыворотках крови людей из 1-3-й групп методом ИФА и при постановке РН антитела к SARS-CoV-2 не выявлены. На момент госпитализации пациентов с COVID-19 в сыворотках крови 12 (19%) больных антитела к SARS-CoV-2 при их определении методами РН и ИФА отсутствовали. В сыворотках крови, взятых спустя 4-9 сут после госпитализации, выявлены вируснейтрализующие антитела и антитела хотя бы к 1 белку вируса в ИФА.

Заключение. На момент госпитализации у подавляющего числа больных был сформирован иммунный ответ к вирусу SARS-CoV-2. В динамике наблюдения уровни антител к белкам SARS-CoV-2 повышались, в большей степени к RBD.

Ключевые слова:COVID-19; антитела к белкам SARS-CoV-2; вируснейтрализующие антитела к SARS-CoV-2

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания № АААА-А20-120081790043-5.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Игнатьев Г.М., Ишмухаметов А.А., Максимов Н.Л., Артемов Е.К., Лиознов Д.А.; сбор материала - Алешенко Н.Л., Даниленко Д.М., Клотченко С.А.; обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста статьи - Козловская Л.И., Мефед К.М., Волок В.П., Пиняева А.Н.; редактирование - Белялетдинова И.Х., Еровиченков А.А.; утверждение окончательного варианта статьи - Игнатьев Г.М., Ишмухаметов А.А.; ответственность за целостность всех частей статьи - Козловская Л.И., Игнатьев Г.М.

Для цитирования: Игнатьев Г.М., Козловская Л.И., Мефед К.М., Волок В.П., Белялетдинова И.Х., Еровиченков А.А., Даниленко Д.М., Алешенко Н.Л., Клотченко С.А., Максимов Н.Л., Артемов Е.К., Пиняева А.Н., Лиознов Д.А., Ишмухаметов А.А. Определение антител к вирусу SARS-CoV-2 у пациентов с новой коронавирусной инфекцией // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2022. Т. 11, № 1. С. 21-27. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2022-11-1-21-27

Первые случаи новой коронавирусной инфекции (COVID-19) были зарегистрированы в конце 2019 г. [1]. Этиологический агент был идентифицирован как β-коронавирус, генетически был сходен с возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) и, таким образом, был назван SARS-CoV-2 [2]. Из-за быстрого роста числа случаев и широкого неконтролируемого распространения по всему миру Всемирная организация здравоохранения объявила пандемию COVID-19 [3]. Быстрое выявление этиологического агента, информации о генетической последовательности вируса и свободный доступ к ней привели к скорой доступности диагностических тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в реальном времени [4]. Молекулярно-генетическая диагностика позволяет провести лабораторное подтверждение заболевания, в то же время серологические исследования позволяют провести эпидемиологическое расследование, дифференцировать случаи бессимптомного течения, изучить тяжесть заболевания и механизмы формирования гуморального противовирусного иммунитета. Эти исследования также важны и необходимы для оценки результатов испытаний вакцинных препаратов.

Вирион SARS-CoV-2 оболочечный, он содержит 4 структурных белка: многодоменный гликопротеин шипика (spike) S; нуклеопротеин N, ассоциированный с РНК-геномом вируса; мембранный белок М и малый оболочечный белок Е - встроенные в липидную оболочку. Белок S определяет первые этапы репликативного цикла вируса: взаимодействие с рецептором АСЕ2 (субъединица S1 через рецептор-связывающий домен RBD), слияние мембран вириона и клетки (субъединица S2) и проникновение нуклеокапсида в цитоплазму. Белки S и N являются основными иммуногенами [4, 5].

Цель исследования - изучение динамики появления вируснейтрализующих антител (ВНА) и антител к белкам вируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19.

Материал и методы

На антитела к N- и S-белкам вируса SARS-CoV-2 проведено тестирование 189 сывороток крови 4 разных групп людей. В 1-ю группу включено 30 сывороток, собранных в 2016 и 2017 гг. от людей в возрасте 20-60 лет в рамках Национальной программы серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики. Во 2-ю группу - 23 сыворотки, полученные до мая 2019 г. от больных с лабораторно подтвержденным диагнозом "острая респираторная вирусная инфекция" (ОРВИ). Из них возбудителями инфекции в 3 случаях был респираторно-синцитиальный вирус; в 12 - риновирусы; в 1 - аденовирус; в 2 - метапневмовирус; вирусы парагриппа - в 2 случаях (1-го и 4-го типа); коронавирусы (сезонные) - 3, из них 2 - Е229, 1 - ОС43. Лабораторное выявление этиологического агента ОРВИ проводили на клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов амплификации с использованием "АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL" (кат. номер R-V57). В 3-ю группу включено 10 сывороток, отобранных у вакцинированных людей, содержащих антитела к вирусу гриппа по результатам реакции торможения гемагглютинации со штаммами вируса гриппа типа А (H1N1, H3N2) и типа В (штаммы линий Виктория и Ямагата). В 4-ю группу - 126 сывороток от 63 пациентов с диагнозом "новая коронавирусная инфекция COVID-19". Все больные находились в условиях стационарного лечения. У всех больных был хотя бы 1 положительный результат ПЦР с детекцией в реальном времени, полученный из носоглоточных смывов. Диагноз "новая коронавирусная инфекция COVID-19" был подтвержден результатами компьютерной томографии.

Сыворотки крови были получены от больных в динамике лечения: 1-я сыворотка - на 1-2-е сутки после госпитализации, 2-я сыворотка - через 4-9 сут после получения первой (интервал между отбором сывороток составил 6,11±0,10 дня). В исследовании использовали парные сыворотки.

Для участия в исследовании получено письменное информированное согласие от всех субъектов или их законных представителей в клинических учреждениях, в которых проводили сбор и первичную обработку сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили с использованием коммерческих наборов для определения IgG к белкам SARS-CoV-2: нуклеокапсида N и спайка S (ООО НПФ "Литех"), а также суммарных антител к RBD (ООО "Биопалитра"), согласно инструкциям производителей. Результаты ИФА представляли в виде индекса антител, рассчитанного согласно инструкциям производителей.

Авидность антител определяли, как описано ранее [9, 10].

Для проведения реакции нейтрализации (РН) использовали штамм ПИК35 SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428852), выделенный из назофарингеального мазка больного СOVID-19. Штамм прошел 4 последовательных пассажа в культуре клеток Vero. Штамм вызывал цитопатическое поражение клеток.

Для проведения РН использовали 2-кратные разведения сыворотки крови, смешивали их с вирусом в дозе 50-200 ТЦД501 в соотношении 1 : 1 для получения серии из 8 разведений, начиная с 1 : 8.

1 ТЦД50 - тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% тест-объектов. - Прим. ред.

Сыворотки крови с внесенным штаммом вируса инкубировали в течение 1 ч при 37 °С, после чего 100 мкл смеси добавляли к монослою клеток Vero в 2 параллелях.

Контроль: титрование положительной и отрицательной референс-сывороток, а также титрование вносимой дозы вируса. Цитопатическое действие вируса оценивали визуально на 5-е сутки после заражения. Расчет титра антител проводили по формуле Кербера [11]. Сыворотки крови, которые в разведении 1 : 8 не вызывали нейтрализацию вируса, считали отрицательными.

Статистическая обработка: рассчитаны экстенсивные показатели, средние логарифмические значения индексов в ИФА, для реакции нейтрализации - средние геометрические титры (СГТ для РН) и их стандартные отклонения с использованием программы OriginPro 8 (OriginLab Corporation, USA).

Результаты и обсуждение

При проведении ИФА сывороток крови из 1-3-й групп антитела к белкам N, S и RBD вируса SARS-CoV-2 не выявлены. Сыворотки крови пациентов 1-3-й групп в РН со штаммом ПИК35 SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428852) также показали отрицательные результаты (титр антител ниже порога определения, <1 : 8). Изученные сыворотки крови были отрицательными как в РН, так и в ИФА, что свидетельствует о специфичности тестов, используемых для определения антител к белкам вируса SARS-CoV-2.

Результаты тестирования сывороток крови на антитела к различным структурам SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19 представлены в таблице.

Результаты тестирования сывороток крови на антитела к SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19

Примечание. IgG N - антитела класса IgG к белку N; IgG S - антитела класса IgG к белку S; АТ RBD - суммарные антитела к рецептор-связывающему домену белка S; РН - реакция нейтрализации; ВНА - вируснейтрализующие антитела; ИФА - иммуноферментный анализ.

На момент госпитализации только у 12 (19,0%) больных антитела к SARS-CoV-2 в сыворотках крови отсутствовали. У 2 (3,2%) пациентов не выявлены антитела ни в одной из используемых тест-систем ИФА, но обнаружены ВНА. У большинства пациентов (49 человек, 77,8%) в ИФА определены антитела к белкам вируса SARS-CoV-2, в 26 сыворотках крови выявлены антитела сразу к нескольким белкам вируса. При этом 25 из этих сывороток крови обладали вируснейтрализующей активностью.

Всего из 38 первых сывороток крови, обладающих вируснейтрализующей активностью, 36 были положительными в реакции ИФА как минимум к одному из белков вируса SARS-CoV-2 (94,7% сывороток крови, положительных в РН, были положительными в ИФА). Из 36 сывороток крови положительных в ИФА и РН 28 (77,7%) были положительными в ИФА с белком RBD.

Во всех исследованных повторных сыворотках крови выявлена вируснейтрализующая активность и они были положительными хотя бы в одной из ИФА тест-систем. Следует отметить, что антитела к белку RBD выявлены во всех 63 сыворотках крови. Из них 55 сывороток были положительными в ИФА на антитела к белкам N, S и RBD, 4 - положительны на белки N и RBD, 3 - положительны к белкам S и RBD и 1 - только к RBD.

Из данных, представленных на рисунке, следует, что значения уровня антител, определенных в ИФА ко всем белкам, увеличивались в динамике наблюдения, при этом в большей степени это относится к антителам к RBD. Рассчитанный средний геометрический титр ВНА также увеличивался в динамике от 0,86±0,81 до 2,14±0,55 lg. При оценке авидности антител в первых сыворотках крови этот показатель составлял 0-11%, а во вторых - 13-31%.

Результаты выявления в динамике вируснейтрализующих антител и антител к белкам SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19

А - титры ВНА (lg) к штамму ПИК35 вируса SARS-CoV-2; B - индексы суммарных антител к белку RBD в ИФА; C - индексы антител класса IgG к белку нуклеокапсида N в ИФА; D - индексы антител класса IgG к белку S в ИФА. * - доля негативных сывороток крови на момент первого взятия указана цифрой на графике; титр негативных сывороток <1 : 8 принят равным нулю для удобства представления; точка 1 - 1-2-е сутки после госпитализации, точка 2 - 4-9-е сутки после госпитализации.

В ходе проведенного исследования было показано, что сыворотки крови людей, перенесших вирусные респираторные инфекции, а также сыворотки крови так называемых интактных доноров, полученных до декабря 2019 г., в использованных тест-системах ИФА с белками вируса SARS-CoV-2 и в РН дали отрицательный результат. Это подтверждает специфичность разработанных тест-систем и отсутствие циркуляции SARS-CoV-2 в тот период среди населения, по крайней мере среди участников 1-3-й групп исследования.

Известно, что сроки появления антител к SARS-CoV-2, определяемых в РН и в ИФА, варьируют от 2 до 11 дней [4-8]. При этом чувствительность тест-систем ИФА выше, если в качестве иммуносорбента использовали домен RBD белка S. С наличием антител к RBD SARS-CoV-2 связывают и вируснейтрализующую активность сывороток крови [4, 6]. Отмечено, что вируснейтрализующая активность сывороток крови коррелирует с тяжестью заболевания: чем тяжелее протекает COVID-19, тем выше вируснейтрализующая активность сыворотки крови больного [5-8]. Показано, что к моменту клинического подтверждения диагноза COVID-19 у больных имеются антитела (определяемые как в ИФА, так и в РН), но их активность быстро снижается [5-8].

Заключение

Длительность и сроки инкубационного периода болезни у больных, включенных в исследование, было сложно установить, но каждому из них при поступлении был выставлен диагноз COVID-19. На фоне признаков пневмонии, высокой температуры тела и сниженной сатурации (SpO2) у 77,7% больных обнаружены специфические антитела к возбудителю, определяемые в ИФА, а у 60,3% выявлены ВНА. Таким образом, на момент госпитализации у подавляющего числа больных был сформирован иммунный ответ к вирусу SARS-CoV-2. Спустя короткий период (4-9 сут) у всех больных сформировались антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью и взаимодействующие с доменом RBD белка S вируса.

Литература

1. Zhou P., Yang X.L., Wang X.G., Hu B., Zhang L., Zhang W. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin // Nature. 2020. Vol. 579, N 7798. P. 270-273. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020- 2012-7

2. Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2 // Nat. Microbiol. 2020. Vol. 5, N 4. P. 536-544. DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-020-0695-z

3. WHO Director-General’s opening remarks at the media briefing on COVID-19, 11 March 2020. World Health Organization, 11 March 2020. https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19---11-march-2020

4. Okba N.M.A., Müller M.A., Li W., Wang C. et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2-specific antibody responses in coronavirus disease patients // Emerg. Infect. Dis. 2020. Vol. 26, N 7. P. 1478-1488. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2607.200841

5. Meyer B., Drosten C., Müller M.A. Serological assays for emerging coronaviruses: challenges and pitfalls // Virus Res. 2014. Vol. 194. P. 175-183. DOI: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.03.018

6. Wu F., Wang A., Liu M., Wang Q. et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications // medRxiv. 2020.03.30.20047365. DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20047365

7. Amanat F., Stadlbauer D., Strohmeier S., Nguyen T.H.O. et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans // Nat. Med. 2020. Vol. 26, N 7. P. 1033-1036. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0913-5

8. Zhao J., Yuan Q., Wang H., Liu W. et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019 // Clin. Infect. Dis. 2020. 2020. Vol. 71, N 16. P. 2027-2034. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciaa344

9. Narita M., Yamada S., Matsuzono Y., Itakura O. et al. Immunoglobulin G avidity testing in serum and cerebrospinal fluid for analysis of measles virus infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1996. Vol. 3, N 2. P. 211-215. DOI: https://doi.org/10.1128/cdli.3.2.211-215.1996

10. Atrasheuskaya A.V., Kulak M.V., Neverov A.A., Rubin S., Ignatyev G.M. Measles cases in highly vaccinated population of Novosibirsk, Russia, 2000-2005 // Vaccine. 2008. Vol. 26, N 17. P. 2111-2118. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2008.02.028

11. Karber G. Beitrag zur kollecktiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche // Arch. Exptl. Pathol. Pharmakol. 1931. Vol. 162. P. 480-483.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Горелов Александр Васильевич
Академик РАН, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины» Минздрава России, профессор кафедры детских болезней Клинического института детского здоровья им. Н.Ф. Филатова ФГАОУ ВО Первый МГМУ им И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), заместитель директора по научной работе ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Российская Федерация)

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»