Изучение эффективности лекарственных препаратов при экспериментальной форме геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Резюме

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - зоонозная природно-очаговая вирусная инфекция, вызывающая у людей заболевание разной степени тяжести в зависимости от серотипа возбудителя.

Цель - оценка протективной эффективности комбинированного применения высокомолекулярного индуктора интерферона (ИФН) ридостина и виразола при экспериментальной форме хантавирусной инфекции у белых мышей.

Материал и методы. Эксперименты по оценке эффективности препаратов выполняли с использованием 12-дневных белых мышей, подкожно инфицированных вирусом Хантаан в дозе 10 ЛД50. Инфекционный титр вируса определяли методом негативных колоний на постоянной культуре клеток почки африканской зеленой мартышки GMK-AH-1(D). Уровни малонового диальдегида, аланини аспартатаминотрансферазы, креатинина и мочевины оценивали с использованием стандартных тест-наборов. Уровни циркуляторного ИФН, продуцируемых лейкоцитами ИФН-α и -γ, определяли по подавлению цитоксичной активности вируса везикулярного стоматита по общепринятому методу.

Результаты и обсуждение. При сочетанном применении препаратов отмечено уменьшение поражения почек (снижение уровней креатинина на 65,8%, мочевины - на 100% в группе леченых животных по отношению к контролю). У инфицированных леченых животных отмечена нормализация функции печени (уровни аланини аспартатаминотрансферазы в пределах нормальных значений) и снижение нарушения в системе перекисного окисления липидов (уменьшение уровня малонового диальдегида на 41,8%). В результате применения препаратов наблюдается практически полная нормализация гематологических показателей у животных (содержание лейкоцитов, лейкоцитарная формула), происходит более выраженная активация системы интерферона, что является благоприятным прогностическим моментом в развитии инфекции.

Ключевые слова:вирус Хантаан, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, креатинин, мочевина, лечение, профилактика, ридостин, рибавирин, белые мыши

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования, сбор данных литературы, написание текста, сбор и обработка материала, редактирование - Логинова С.Я.; сбор и обработка материала, статистический анализ, написание текста - Ковальчук А.В.; сбор и обработка материала, статистический анализ, написание текста - Щукина В.Н.; сбор и обработка материала - Савенко С.В.; написание текста, редактирование - Борисевич С.В.

Для цитирования: Логинова С.Я., Ковальчук А.В., Щукина В.Н., Савенко С.В., Борисевич С.В. Изучение эффективности лекарственных препаратов при экспериментальной форме геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2021. Т. 10, № 3. С. 98-105. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2021-10-3-98-105

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - зоонозная природно-очаговая вирусная инфекция. К настоящему времени известно более чем о 500 штаммах хантавирусов, включая 120, выделенных на территории бывшего СССР [1-3]. Все они объединены в 8 серотипов, входящих в род Hantavirus, семейство Bunyaviridae, и только 4 из них (Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава/Белград) вызывают заболевание людей, объединенное названием ГЛПС [2, 4].

Вирус Хантаан чаще других вызывает тяжелые и среднетяжелые формы течения ГЛПС [5, 6]. Клиническая картина ГЛПС отличается разнообразием проявлений. Выраженный полиморфизм симптоматики, безусловно, связан с генерализованным повреждающим действием вируса на эндотелий сосудов микроциркулярного русла, влекущим за собой нарушение внутриорганной гемодинамики, развитие диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) и острую почечную недостаточность [7, 8]. Кроме клинических проявлений, характеристикой тяжести течения болезни служит степень изменения биохимических показателей, характеризующих нарушения функции почек и печени, нарушения в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ), гематологических показателей, а также показателей интерферонового статуса организма [9, 10].

В настоящее время для лечения ГЛПС рекомендовано использование рибавирина. Клинические исследования с использованием рибавирина для лечения пациентов с ГЛПС показывают, что он обеспечивает улучшение прогноза при назначении на ранних стадиях заболевания [11]. Однако, учитывая тяжесть течения ГЛПС, существует потребность в оценке эффективности схем применения противовирусных препаратов для лечения тяжелых форм заболевания.

Достижения молекулярной биологии вирусов позволили выявить общие пути направленного вмешательства в репродукцию вирусов, найти основные мишени, на которые нацелены противовирусные вещества. При этом оптимально использование нескольких групп противовирусных препаратов с синергидным или аддитивным эффектом. Ранее нами была изучена эффективность комбинированного применения индуктора интерферона амиксин и химиопрепарата виразол (рибавирин) в отношении экспериментальной хантавирусной инфекции у белых мышей [12].

Цель настоящей работы - оценка протективной эффективности комбинированного применения высокомолекулярного индуктора интерферона (ИФН) ридостина и виразола в отношении экспериментальной формы хантавирусной инфекции у белых мышей.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали возбудитель ГЛПС вирус Хантаан, штамм 76-118, полученный из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и хранящийся в музее "48 ЦНИИ" Минобороны России.

Культура клеток. Использована перевиваемая культура клеток почек зеленых мартышек - GMK-AH-1(D). В качестве среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 2% сыворотки крупного рогатого скота. Перед применением препараты растворяли в физиологическом растворе.

Исследуемые препараты. Ридостин (инъекционный) - дрожжевая двуспиральная РНК производства ЗАО "ВекторМедика" (Кольцово, Россия), виразол (Pharmacia Inc, США). Препараты растворяли в стерильном физиологическом растворе, вводили животным внутримышечно.

Оценка биологических свойств вируса. Биологическую активность вируса Хантаан оценивали титрованием в культуре клеток GMK-AH-1(D) по формированию негативных колоний (lg БОЕ/мл).

Оценка противовирусной эффективности экспериментальных субстанций осуществлена в соответствии с рекомендациями ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России [13].

Лабораторные животные. В работе использовали 12-суточных нелинейных белых мышей, полученных из вивария ФГБУ "48 ЦНИИ" Минобороны России. Мышей инфицировали подкожно вирусом Хантаан в дозе 10 ЛД (106 БОЕ).

Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 сут, при этом контролировали гибель дважды в течение дня. Через 3, 8 и 12 сут после заражения отбирали кровь для оценки уровня сывороточного интерферона, активности аланини аспартатаминотрансферазы, концентрации креатинина и мочевины, подсчета количества лейкоцитов в единице объема крови и лейкоцитарной формулы.

Коэффициент изменения значения показателя (Киз, процент) рассчитывали по формуле:

где Анелеч - значение показателя в группе нелеченных животных; Алеч - значение показателя в группе леченных животных; Аинтактн - значение показателя у интактных животных.

Основным критерием оценки эффективности был показатель защиты животных от гибели (%). Дополнительными критериями служили показатель среднего времени жизни животных в группе, снижение уровня вирусной нагрузки в тканях головного мозга (Δ, lg), нормализация биохимических и гематологических показателей крови.

Результаты и обсуждение

Схема сочетанного применения включала введение виразола через 2 ч после заражения животных, далее 5 сут 1 раз в день, и ридостина через 6 ч, далее на 3, 6 и 9-е сутки 1 раз в день.

При изучении клинико-вирусологических показателей экспериментальной инфекции у мышей 12-суточного возраста, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, установлено, что инфекция протекает манифестно и приводит к гибели животных в период с 6-х по 12-е сутки после инфицирования. Началом инфекции является активная репродукция вируса в легких с последующей диссеминацией возбудителя. Начиная с 5-х суток отмечается накопление возбудителя в возрастающей концентрации в головном мозге животных, которое достигает максимального уровня в период с 8-х до 12-х суток после инфицирования, т.е. совпадает со временем наивысшей частоты гибели зараженных животных.

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что при сочетанном применении препараты виразол и ридостин оказывают выраженный защитный эффект в отношении экспериментальной хантавирусной инфекции мышей. Протективная эффективность составила 72%, увеличение среднего времени жизни - 10,1 сут. Уровень накопления возбудителя в тканях головного мозга погибших животных снижался на 2,8 1g БОЕ/г. Выживаемость инфицированных животных при комбинированном применении препаратов статистически достоверно выше, чем при монотерапии, достоверно ниже уровень репродукции вируса в тканях головного мозга (р<0,05).

Были изучены вспомогательные показатели эффективности сочетанного применения препаратов. Изменения биохимических, гематологических показателей и показателей интерферонового статуса при экспериментальной хантавирусной инфекции мышей выявляют патологические сдвиги, которые имеют схожесть с таковыми при заболевании человека, что позволяет рассматривать данных животных в качестве лабораторной модели, адекватной заболеванию человека по данным патологическим изменениям.

У больных ГЛПС развиваются значительное нарушение функции почек и печени. В частности, биохимическими показателями, характеризующими степень поражения данных органов, являются концентрация креатинина, мочевины, аланин(АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыво-

ротке крови. Увеличение этих показателей у больных ГЛПС является одной из характеристик степени тяжести заболевания [9, 10]. При экспериментальной хантавирусной инфекции у мышей также отмечается увеличение уровня данных показателей (на 8-е сутки после инфицирования уровень креатинина увеличивается в 2,6 раза, мочевины - в 1,6 раза, АЛТ и АСТ - в 2,4 и 1,9 раза соответственно), что свидетельствует о развитии у животных поражения почек и печени.

Таблица 1. Результаты изучения протективной эффективности сочетанного применения виразола и ридостина в отношении экспериментальной инфекции мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД50 (n=3)

В патогенезе вирусных заболеваний важную роль играют процессы дестабилизации клеточных мембран. В последние годы установлено, что среди механизмов повреждения мембран наиболее важное значение имеют нарушения в системе ПОЛ. Комплексное изучение интенсивности процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы у больных ГЛПС позволило выявить наличие прямой корреляционной зависимости между степенью тяжести заболевания и степенью увеличения интенсивности процессов ПОЛ, сопровождающееся снижением компенсаторной возможности антиоксидантной системы [14]. Одним из наиболее часто используемых в практической медицине показателей, характеризующих нарушения в системе ПОЛ, является уровень малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови.

Изучение в динамике уровня МДА в сыворотке крови мышей 12-суточного возраста позволило установить, что в процессе развития экспериментальной инфекции нарушения в системе ПОЛ появляются в начальный период заболевания и сохраняются вплоть до гибели животных.

Результаты изучения влияния сочетанного применения виразола и ридостина на изменение биохимических показателей, характеризующих нарушение функции почек, печени и нарушения в системе ПОЛ в процессе развития экспериментальной инфекции у мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, представлены в табл. 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в группе животных, леченных виразолом в комбинации с ридостином, отмечается статистически достоверное снижение по отношению к контролю уровня всех изученных биохимических показателей. Наибольшая выраженность изменений зафиксирована на 8-е сутки после инфицирования, что соответствует пику инфекции.

Снижение уровней креатинина в группе лечения по отношению к контролю на 8-е сутки после инфицирования составляет 142,7 мкМ/л, мочевины - 4,5 мМ/л, АЛТ - 11,03 мкМ/(ч×л), АСТ - 0,84 мкМ/(ч×л), МДА - 7,4 мкМ/л. Таким образом, в результате комбинированного применения препаратов отмечена нормализация функции почек и печени, а также изменений в системе ПОЛ, вызываемых развитием экспериментальной инфекции мышей при подкожном инфицировании вирусом Хантаан.

Изучение в динамике таких гематологических показателей, как уровень лейкоцитов крови и лейкоцитарная формула, позволяет более объективно судить о патологических процессах, развивающихся при экспериментальной хантавирусной инфекции. Увеличение уровня лейкоцитов крови наблюдается в начальный период инфекции и достигает максимальной степени выраженности на 8-е сутки после инфицирования. Степень выраженности изменения показателя позволяет судить о реактивности организма в ответ на развитие инфекции. Однако при значительном лейкоцитозе прогноз заболевания не всегда может быть благоприятным. В этой связи большое значение имеет соотношение различных групп клеток в лейкоцитарном пуле - лейкоцитарная формула. При анализе лейкоцитарной формулы крови у белых мышей, инфицированных вирусом Хантаан, отмечается увеличение по отношению к интактным животным относительного количества нейтрафильных гранулоцитов и эозинофилов на фоне снижения относительного количества лимфоцитов. В соответствии с данными литературы, схожие изменения изученных гематологических показателей наблюдаются у больных ГЛПС [15]. Максимальные изменения гематологических показателей отмечаются в олигурической стадии заболевания, и их выраженность является одной из характеристик степени тяжести болезни.

Таблица 2. Результаты определения в динамике биохимических показателей в сыворотке крови белых мышей, подкожно инфицированных вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД, при сочетанном применении ридостина и виразола (n=3)

Таблица 3. Результаты определения в динамике показателей крови белых мышей, подкожно инфицированных вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД50, при сочетанном применении ридостина и виразола (n=3)

С целью оценки влияния сочетанного применения препаратов на изменение в динамике гематологических показателей, характеризующих систему иммунитета в процессе развития экспериментальной инфекции, проведено сравнительное изучение в динамике общего содержания лейкоцитов в 1 мкл крови, а также лейкоцитарной формулы. Для этого у животных на 3, 8, и 12-е сутки после инфицирования отбирали пробы крови и проводили подсчет количества лейкоцитов в единице объема крови и лейкоцитарной формулы. Результаты представлены в табл. 3.

Результаты исследования свидетельствуют, что в группе животных, получавших виразол в сочетании с ридостином, отмечается статистически достоверное (р<0,05) уменьшение изменений исследуемых показателей по отношению к контролю. Наибольшую выраженность изменений показателей отмечали на 8-е сутки после инфицирования (на пике развития инфекции). Снижение концентрации лейкоцитов на 8-е сутки после инфицирования составляет 10,4 × 103 клеток/мкл, относительного количества сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов - 16,3 и 7,0% соответственно, эозинофилов - 3,3%, относительное количество лимфоцитов - более на 21,0%.

Таким образом, в результате сочетанного применения виразола и ридостина отмечается нормализация изменений гематологических показателей, возникающих в результате развития экспериментальной инфекции у мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, штамм 76-118.

Одним из выраженных показателей острой вирусной инфекции являются специфические изменения в системе ИФН. В связи с тем, что мыши 12-суточного возраста не являются половозрелыми, изучение в динамике показателей интерферонового статуса в процессе развития экспериментальной инфекции у данных лабораторных животных имеет особое значение. В результате проведенных исследований было установлено, что в процессе развития экспериментальной инфекции у мышей происходит значительное увеличение уровня цИФН (в 70 раз на пике инфекции) и одновременно с этим снижается интерферон-продуцирующая способность лейкоцитов крови в ответ на стимуляцию in vitro (ИФН-α - в 7 раз, ИФН-γ - в 2 раза на 8-е сутки после инфицирования) (табл. 4). Данные изменения в системе интерферона характерны для острых вирусных инфекций, которые, в соответствии с данными литературы, также наблюдаются и у больных ГЛПС [16].

С целью оценки влияния сочетанного применения препаратов на изменение показателей интерферонового статуса у инфицированных животных по отношению к контролю, проведено определение в динамике уровня цИФН, а также уровня продукции ИФН-α и -γ лейкоцитами крови, индуцированными in vitro.

Таблица 4. Результаты определения в динамике показателей интерферонового статуса белых мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД50 при сочетанном применении виразола и ридостина (n=3)

Таблица 5. Результаты изучения влияния сочетанного применения виразола и ридостина на изменения биохимических, гематологических показателей и показателей интерферонового статуса у мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан в дозе 10 ЛД50 (n=3)

Полученные результаты свидетельствуют, о том, что в группе животных, принимавших виразол в комбинации с ридостином, отмечается статистически достоверное (р<0,05) увеличение по отношению к контролю уровня цИФН и снижение уровня продукции ИФН-γ лейкоцитами крови, индуцированными in vitro, на ранние сроки развития инфекции. Наибольшая выраженность изменений показателей отмечается на 8-е и 9-е сутки после инфицирования, на пике развития инфекции у животных. Такого рода изменения показателей интерферонового статуса обусловливают более благоприятное развитие инфекции.

По результатам изучения влияния сочетанного применения препаратов на изменения биохимических, гематологических показателей и показателей интерферонового статуса был определен коэффициент изменения значения показателя (Киз, %).

Анализ полученных данных свидетельствует, что в результате сочетанного применения препаратов отмечается значительное уменьшение поражения почек (уменьшение уровней креатинина на 65,8% и мочевины - на 100% в группе леченых животных по отношению к контролю). Также у леченых животных нормализуются биохимические показатели концентрации АЛТ и АСТ и значительно уменьшаются нарушения в системе ПОЛ (уменьшение уровня МДА на 41,8%).

Следовательно, в результате комбинированного применения препаратов наблюдается практически полная нормализация гематологических и биохимических показателей крови, более выраженная активация системы ИФН, что является благоприятным прогностическим моментом в развитии инфекции.

Таким образом, исследования по изучению комбинированного применения препаратов с различным механизмом действия свидетельствуют о перспективности использования комбинированного использования виразола и ридостина для терапии ГЛПС.

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Ющук Николай Дмитриевич
Академик РАН, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, президент ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России, член Правления Национального научного общества инфекционистов.
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
III Конгресс "Психическое здоровье человека XXI века"

ДЕТИ. ОБЩЕСТВО. БУДУЩЕЕ. III Конгресс "Психическое здоровье человека XXI века" Более 10 тысяч медицинских и немедицинских специалистов в сфере охраны психического здоровья, а также представителей социально-ориентированных НКО, деловых кругов, СМИ из 37 стран стали...

II Национальный междисциплинарный конгресс "Времена года. Женское здоровье от юного до серебряного и золотого возраста".

Пресс-релиз 21 и 22 октября 2021 года состоится II Национальный междисциплинарный конгресс "Времена года. Женское здоровье от юного до серебряного и золотого возраста" . Конгресс будет посвящен 20-летию Российской Ассоциации Маммологов и 15-летию первой кафедры клинической...

VIII Байкальские офтальмологические чтения "Визуализация в офтальмологии. Настоящее и будущее"

VIII Байкальские офтальмологические чтения "Визуализация в офтальмологии. Настоящее и будущее" 4-5 декабря 2021 года состоится Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием VIII Байкальские офтальмологические чтения "Визуализация в офтальмологии....


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»