Изучение эффективности лекарственных препаратов при экспериментальной форме геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Резюме

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - зоонозная природно-очаговая вирусная инфекция, вызывающая у людей заболевание разной степени тяжести в зависимости от серотипа возбудителя.

Цель - оценка протективной эффективности комбинированного применения высокомолекулярного индуктора интерферона (ИФН) ридостина и виразола при экспериментальной форме хантавирусной инфекции у белых мышей.

Материал и методы. Эксперименты по оценке эффективности препаратов выполняли с использованием 12-дневных белых мышей, подкожно инфицированных вирусом Хантаан в дозе 10 ЛД50. Инфекционный титр вируса определяли методом негативных колоний на постоянной культуре клеток почки африканской зеленой мартышки GMK-AH-1(D). Уровни малонового диальдегида, аланини аспартатаминотрансферазы, креатинина и мочевины оценивали с использованием стандартных тест-наборов. Уровни циркуляторного ИФН, продуцируемых лейкоцитами ИФН-α и -γ, определяли по подавлению цитоксичной активности вируса везикулярного стоматита по общепринятому методу.

Результаты и обсуждение. При сочетанном применении препаратов отмечено уменьшение поражения почек (снижение уровней креатинина на 65,8%, мочевины - на 100% в группе леченых животных по отношению к контролю). У инфицированных леченых животных отмечена нормализация функции печени (уровни аланини аспартатаминотрансферазы в пределах нормальных значений) и снижение нарушения в системе перекисного окисления липидов (уменьшение уровня малонового диальдегида на 41,8%). В результате применения препаратов наблюдается практически полная нормализация гематологических показателей у животных (содержание лейкоцитов, лейкоцитарная формула), происходит более выраженная активация системы интерферона, что является благоприятным прогностическим моментом в развитии инфекции.

Ключевые слова:вирус Хантаан, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, креатинин, мочевина, лечение, профилактика, ридостин, рибавирин, белые мыши

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования, сбор данных литературы, написание текста, сбор и обработка материала, редактирование - Логинова С.Я.; сбор и обработка материала, статистический анализ, написание текста - Ковальчук А.В.; сбор и обработка материала, статистический анализ, написание текста - Щукина В.Н.; сбор и обработка материала - Савенко С.В.; написание текста, редактирование - Борисевич С.В.

Для цитирования: Логинова С.Я., Ковальчук А.В., Щукина В.Н., Савенко С.В., Борисевич С.В. Изучение эффективности лекарственных препаратов при экспериментальной форме геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2021. Т. 10, № 3. С. 98-105. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2021-10-3-98-105

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - зоонозная природно-очаговая вирусная инфекция. К настоящему времени известно более чем о 500 штаммах хантавирусов, включая 120, выделенных на территории бывшего СССР [1-3]. Все они объединены в 8 серотипов, входящих в род Hantavirus, семейство Bunyaviridae, и только 4 из них (Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава/Белград) вызывают заболевание людей, объединенное названием ГЛПС [2, 4].

Вирус Хантаан чаще других вызывает тяжелые и среднетяжелые формы течения ГЛПС [5, 6]. Клиническая картина ГЛПС отличается разнообразием проявлений. Выраженный полиморфизм симптоматики, безусловно, связан с генерализованным повреждающим действием вируса на эндотелий сосудов микроциркулярного русла, влекущим за собой нарушение внутриорганной гемодинамики, развитие диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) и острую почечную недостаточность [7, 8]. Кроме клинических проявлений, характеристикой тяжести течения болезни служит степень изменения биохимических показателей, характеризующих нарушения функции почек и печени, нарушения в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ), гематологических показателей, а также показателей интерферонового статуса организма [9, 10].

В настоящее время для лечения ГЛПС рекомендовано использование рибавирина. Клинические исследования с использованием рибавирина для лечения пациентов с ГЛПС показывают, что он обеспечивает улучшение прогноза при назначении на ранних стадиях заболевания [11]. Однако, учитывая тяжесть течения ГЛПС, существует потребность в оценке эффективности схем применения противовирусных препаратов для лечения тяжелых форм заболевания.

Достижения молекулярной биологии вирусов позволили выявить общие пути направленного вмешательства в репродукцию вирусов, найти основные мишени, на которые нацелены противовирусные вещества. При этом оптимально использование нескольких групп противовирусных препаратов с синергидным или аддитивным эффектом. Ранее нами была изучена эффективность комбинированного применения индуктора интерферона амиксин и химиопрепарата виразол (рибавирин) в отношении экспериментальной хантавирусной инфекции у белых мышей [12].

Цель настоящей работы - оценка протективной эффективности комбинированного применения высокомолекулярного индуктора интерферона (ИФН) ридостина и виразола в отношении экспериментальной формы хантавирусной инфекции у белых мышей.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали возбудитель ГЛПС вирус Хантаан, штамм 76-118, полученный из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и хранящийся в музее "48 ЦНИИ" Минобороны России.

Культура клеток. Использована перевиваемая культура клеток почек зеленых мартышек - GMK-AH-1(D). В качестве среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 2% сыворотки крупного рогатого скота. Перед применением препараты растворяли в физиологическом растворе.

Исследуемые препараты. Ридостин (инъекционный) - дрожжевая двуспиральная РНК производства ЗАО "ВекторМедика" (Кольцово, Россия), виразол (Pharmacia Inc, США). Препараты растворяли в стерильном физиологическом растворе, вводили животным внутримышечно.

Оценка биологических свойств вируса. Биологическую активность вируса Хантаан оценивали титрованием в культуре клеток GMK-AH-1(D) по формированию негативных колоний (lg БОЕ/мл).

Оценка противовирусной эффективности экспериментальных субстанций осуществлена в соответствии с рекомендациями ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России [13].

Лабораторные животные. В работе использовали 12-суточных нелинейных белых мышей, полученных из вивария ФГБУ "48 ЦНИИ" Минобороны России. Мышей инфицировали подкожно вирусом Хантаан в дозе 10 ЛД (106 БОЕ).

Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 сут, при этом контролировали гибель дважды в течение дня. Через 3, 8 и 12 сут после заражения отбирали кровь для оценки уровня сывороточного интерферона, активности аланини аспартатаминотрансферазы, концентрации креатинина и мочевины, подсчета количества лейкоцитов в единице объема крови и лейкоцитарной формулы.

Коэффициент изменения значения показателя (Киз, процент) рассчитывали по формуле:

где Анелеч - значение показателя в группе нелеченных животных; Алеч - значение показателя в группе леченных животных; Аинтактн - значение показателя у интактных животных.

Основным критерием оценки эффективности был показатель защиты животных от гибели (%). Дополнительными критериями служили показатель среднего времени жизни животных в группе, снижение уровня вирусной нагрузки в тканях головного мозга (Δ, lg), нормализация биохимических и гематологических показателей крови.

Результаты и обсуждение

Схема сочетанного применения включала введение виразола через 2 ч после заражения животных, далее 5 сут 1 раз в день, и ридостина через 6 ч, далее на 3, 6 и 9-е сутки 1 раз в день.

При изучении клинико-вирусологических показателей экспериментальной инфекции у мышей 12-суточного возраста, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, установлено, что инфекция протекает манифестно и приводит к гибели животных в период с 6-х по 12-е сутки после инфицирования. Началом инфекции является активная репродукция вируса в легких с последующей диссеминацией возбудителя. Начиная с 5-х суток отмечается накопление возбудителя в возрастающей концентрации в головном мозге животных, которое достигает максимального уровня в период с 8-х до 12-х суток после инфицирования, т.е. совпадает со временем наивысшей частоты гибели зараженных животных.

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что при сочетанном применении препараты виразол и ридостин оказывают выраженный защитный эффект в отношении экспериментальной хантавирусной инфекции мышей. Протективная эффективность составила 72%, увеличение среднего времени жизни - 10,1 сут. Уровень накопления возбудителя в тканях головного мозга погибших животных снижался на 2,8 1g БОЕ/г. Выживаемость инфицированных животных при комбинированном применении препаратов статистически достоверно выше, чем при монотерапии, достоверно ниже уровень репродукции вируса в тканях головного мозга (р<0,05).

Были изучены вспомогательные показатели эффективности сочетанного применения препаратов. Изменения биохимических, гематологических показателей и показателей интерферонового статуса при экспериментальной хантавирусной инфекции мышей выявляют патологические сдвиги, которые имеют схожесть с таковыми при заболевании человека, что позволяет рассматривать данных животных в качестве лабораторной модели, адекватной заболеванию человека по данным патологическим изменениям.

У больных ГЛПС развиваются значительное нарушение функции почек и печени. В частности, биохимическими показателями, характеризующими степень поражения данных органов, являются концентрация креатинина, мочевины, аланин(АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыво-

ротке крови. Увеличение этих показателей у больных ГЛПС является одной из характеристик степени тяжести заболевания [9, 10]. При экспериментальной хантавирусной инфекции у мышей также отмечается увеличение уровня данных показателей (на 8-е сутки после инфицирования уровень креатинина увеличивается в 2,6 раза, мочевины - в 1,6 раза, АЛТ и АСТ - в 2,4 и 1,9 раза соответственно), что свидетельствует о развитии у животных поражения почек и печени.

Таблица 1. Результаты изучения протективной эффективности сочетанного применения виразола и ридостина в отношении экспериментальной инфекции мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД50 (n=3)

В патогенезе вирусных заболеваний важную роль играют процессы дестабилизации клеточных мембран. В последние годы установлено, что среди механизмов повреждения мембран наиболее важное значение имеют нарушения в системе ПОЛ. Комплексное изучение интенсивности процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы у больных ГЛПС позволило выявить наличие прямой корреляционной зависимости между степенью тяжести заболевания и степенью увеличения интенсивности процессов ПОЛ, сопровождающееся снижением компенсаторной возможности антиоксидантной системы [14]. Одним из наиболее часто используемых в практической медицине показателей, характеризующих нарушения в системе ПОЛ, является уровень малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови.

Изучение в динамике уровня МДА в сыворотке крови мышей 12-суточного возраста позволило установить, что в процессе развития экспериментальной инфекции нарушения в системе ПОЛ появляются в начальный период заболевания и сохраняются вплоть до гибели животных.

Результаты изучения влияния сочетанного применения виразола и ридостина на изменение биохимических показателей, характеризующих нарушение функции почек, печени и нарушения в системе ПОЛ в процессе развития экспериментальной инфекции у мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, представлены в табл. 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в группе животных, леченных виразолом в комбинации с ридостином, отмечается статистически достоверное снижение по отношению к контролю уровня всех изученных биохимических показателей. Наибольшая выраженность изменений зафиксирована на 8-е сутки после инфицирования, что соответствует пику инфекции.

Снижение уровней креатинина в группе лечения по отношению к контролю на 8-е сутки после инфицирования составляет 142,7 мкМ/л, мочевины - 4,5 мМ/л, АЛТ - 11,03 мкМ/(ч×л), АСТ - 0,84 мкМ/(ч×л), МДА - 7,4 мкМ/л. Таким образом, в результате комбинированного применения препаратов отмечена нормализация функции почек и печени, а также изменений в системе ПОЛ, вызываемых развитием экспериментальной инфекции мышей при подкожном инфицировании вирусом Хантаан.

Изучение в динамике таких гематологических показателей, как уровень лейкоцитов крови и лейкоцитарная формула, позволяет более объективно судить о патологических процессах, развивающихся при экспериментальной хантавирусной инфекции. Увеличение уровня лейкоцитов крови наблюдается в начальный период инфекции и достигает максимальной степени выраженности на 8-е сутки после инфицирования. Степень выраженности изменения показателя позволяет судить о реактивности организма в ответ на развитие инфекции. Однако при значительном лейкоцитозе прогноз заболевания не всегда может быть благоприятным. В этой связи большое значение имеет соотношение различных групп клеток в лейкоцитарном пуле - лейкоцитарная формула. При анализе лейкоцитарной формулы крови у белых мышей, инфицированных вирусом Хантаан, отмечается увеличение по отношению к интактным животным относительного количества нейтрафильных гранулоцитов и эозинофилов на фоне снижения относительного количества лимфоцитов. В соответствии с данными литературы, схожие изменения изученных гематологических показателей наблюдаются у больных ГЛПС [15]. Максимальные изменения гематологических показателей отмечаются в олигурической стадии заболевания, и их выраженность является одной из характеристик степени тяжести болезни.

Таблица 2. Результаты определения в динамике биохимических показателей в сыворотке крови белых мышей, подкожно инфицированных вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД, при сочетанном применении ридостина и виразола (n=3)

Таблица 3. Результаты определения в динамике показателей крови белых мышей, подкожно инфицированных вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД50, при сочетанном применении ридостина и виразола (n=3)

С целью оценки влияния сочетанного применения препаратов на изменение в динамике гематологических показателей, характеризующих систему иммунитета в процессе развития экспериментальной инфекции, проведено сравнительное изучение в динамике общего содержания лейкоцитов в 1 мкл крови, а также лейкоцитарной формулы. Для этого у животных на 3, 8, и 12-е сутки после инфицирования отбирали пробы крови и проводили подсчет количества лейкоцитов в единице объема крови и лейкоцитарной формулы. Результаты представлены в табл. 3.

Результаты исследования свидетельствуют, что в группе животных, получавших виразол в сочетании с ридостином, отмечается статистически достоверное (р<0,05) уменьшение изменений исследуемых показателей по отношению к контролю. Наибольшую выраженность изменений показателей отмечали на 8-е сутки после инфицирования (на пике развития инфекции). Снижение концентрации лейкоцитов на 8-е сутки после инфицирования составляет 10,4 × 103 клеток/мкл, относительного количества сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов - 16,3 и 7,0% соответственно, эозинофилов - 3,3%, относительное количество лимфоцитов - более на 21,0%.

Таким образом, в результате сочетанного применения виразола и ридостина отмечается нормализация изменений гематологических показателей, возникающих в результате развития экспериментальной инфекции у мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, штамм 76-118.

Одним из выраженных показателей острой вирусной инфекции являются специфические изменения в системе ИФН. В связи с тем, что мыши 12-суточного возраста не являются половозрелыми, изучение в динамике показателей интерферонового статуса в процессе развития экспериментальной инфекции у данных лабораторных животных имеет особое значение. В результате проведенных исследований было установлено, что в процессе развития экспериментальной инфекции у мышей происходит значительное увеличение уровня цИФН (в 70 раз на пике инфекции) и одновременно с этим снижается интерферон-продуцирующая способность лейкоцитов крови в ответ на стимуляцию in vitro (ИФН-α - в 7 раз, ИФН-γ - в 2 раза на 8-е сутки после инфицирования) (табл. 4). Данные изменения в системе интерферона характерны для острых вирусных инфекций, которые, в соответствии с данными литературы, также наблюдаются и у больных ГЛПС [16].

С целью оценки влияния сочетанного применения препаратов на изменение показателей интерферонового статуса у инфицированных животных по отношению к контролю, проведено определение в динамике уровня цИФН, а также уровня продукции ИФН-α и -γ лейкоцитами крови, индуцированными in vitro.

Таблица 4. Результаты определения в динамике показателей интерферонового статуса белых мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, штамм 76-118 в дозе 10 ЛД50 при сочетанном применении виразола и ридостина (n=3)

Таблица 5. Результаты изучения влияния сочетанного применения виразола и ридостина на изменения биохимических, гематологических показателей и показателей интерферонового статуса у мышей, инфицированных подкожно вирусом Хантаан в дозе 10 ЛД50 (n=3)

Полученные результаты свидетельствуют, о том, что в группе животных, принимавших виразол в комбинации с ридостином, отмечается статистически достоверное (р<0,05) увеличение по отношению к контролю уровня цИФН и снижение уровня продукции ИФН-γ лейкоцитами крови, индуцированными in vitro, на ранние сроки развития инфекции. Наибольшая выраженность изменений показателей отмечается на 8-е и 9-е сутки после инфицирования, на пике развития инфекции у животных. Такого рода изменения показателей интерферонового статуса обусловливают более благоприятное развитие инфекции.

По результатам изучения влияния сочетанного применения препаратов на изменения биохимических, гематологических показателей и показателей интерферонового статуса был определен коэффициент изменения значения показателя (Киз, %).

Анализ полученных данных свидетельствует, что в результате сочетанного применения препаратов отмечается значительное уменьшение поражения почек (уменьшение уровней креатинина на 65,8% и мочевины - на 100% в группе леченых животных по отношению к контролю). Также у леченых животных нормализуются биохимические показатели концентрации АЛТ и АСТ и значительно уменьшаются нарушения в системе ПОЛ (уменьшение уровня МДА на 41,8%).

Следовательно, в результате комбинированного применения препаратов наблюдается практически полная нормализация гематологических и биохимических показателей крови, более выраженная активация системы ИФН, что является благоприятным прогностическим моментом в развитии инфекции.

Таким образом, исследования по изучению комбинированного применения препаратов с различным механизмом действия свидетельствуют о перспективности использования комбинированного использования виразола и ридостина для терапии ГЛПС.

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Ющук Николай Дмитриевич
Академик РАН, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, президент ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России, член Правления Национального научного общества инфекционистов.
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Пост-релиз "Молекулярная диагностика"

Молекулярная диагностика на страже "биопорядка": как современные технологии позволяют выжить в век эпидемий Новые технологии молекулярной диагностики в эпоху COVID-19/пандемий Обеспечение массового экспресс-тестирования населения - приоритетная задача, которая поможет...

"Муковисцидоз: из детства во взрослую жизнь"

Всероссийская школа по Муковисцидозу с международным участием "Муковисцидоз: из детства во взрослую жизнь" С 24 по 25 ноября 2021 года профессионалы в области педиатрии, терапии, пульмонологии, гастроэнтерологии, эндокринологии, генетики, диетологии, микробиологии,...

Амбулаторный прием 24 ноября.

Коморбидность - бич современного общества и головная боль для каждого терапевта. Как минимизировать комбинации препаратов и, как следствие, побочных эффектов у больных с сочетанной патологией? Именно этот злободневный вопрос мы задали ведущим экспертам российского...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»