Особенности структуры генома штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов, позволяющие проводить внутривидовую дифференциацию

• Трухачев Алексей Леонидович
• Лебедева Светлана Александровна
• Васильева Екатерина Анатольевна
• Ракин Александр Владимирович

Резюме

Геномы штаммов различных подвидов возбудителя чумы неоднородны. В процессе формирования различных подвидов и биотипов Yersinia pestis при эволюционном развитии появились специфические метки в геномах этих групп штаммов. Одним из отличительных признаков является неоднородность нуклеотидных последовательностей плазмиды pFra у различных подвидов.

Материал и методы. В статье представлены данные о структурной организации pFra плазмиды у различных подвидов возбудителя чумы.

Результаты и обсуждение. Изучение 87 штаммов Y. pestis подтвердило наличие нуклеотидной последовательности (CDS38-CDS40). Эти последовательности стабильно присутствуют в плазмиде pFra штаммов неосновных подвидов и отсутствуют у штаммов основного подвида. Характерной особенностью штаммов подвида caucasica также является присутствие в pFra большого фрагмента ДНК, содержащего гены tra-оперона. Исследование состава генов tra-оперона выявило ряд стабильно присутствующих генов в pFra этого подвида. На основании результатов исследования выбраны специфические последовательности, использованные для создания набора, который позволяет дифференцировать штаммы основного подвида от штаммов неосновных подвидов, а также выявлять штаммы подвида caucasica. Представлен вариант схемы идентификации внутривидовой дифференциации Y. pestis.

Ключевые слова:чума, внутривидовая дифференциация Y pestis, плазмида pFra

Возбудитель чумы в эволюционном плане сравнительно молодой микроорганизм. Формирование его произошло, скорее всего, поэтапно в процессе эволюции. Приобретение сначала одной, затем второй видоспецифической плазмиды, целый ряд микроэволюционных мутационных изменений в хромосомных генах за счет делеций или встройки дополнительных фрагментов - все это определило специфичность микроба и появление особых биологических свойств, определивших его патогенность для грызунов и человека. Известная современная полиморфность вида Y. pestis - свидетельство его продолжающейся прогрессивной и регрессивной эволюции в различных географических группах, которая обеспечивает выживание микроба в конкретных условиях природного очага. Географическая обособленность очагов распространения фенотипически дискретных групп Y. pestis и особенности необычной рамнозопозитивной полевочьей разновидности чумного микроба [1] позволили специалистам предложить деление вида Y. pestis на подвиды. В результате вид оказался представлен одним основным рамнозонегативным подвидом ssp. pestis и пятью неосновными рамнозопозитивными подвидами: caucasica, altaica, hissarica, ulegeica, talassica.

Одной из особенностей штаммов неосновных подвидов является увеличение молекулярной массы самой высокомолекулярной видоспецифической плазмиды pFra, определяющей у основного подвида продукцию капсульного антигена F1 и мышиного токсина [2-4]. У всех штаммов подвида caucasica величина плазмиды достигает 90 МДа, тогда как у представителей остальных неосновных подвидов она может варьировать от 85 до 70 МДа, хотя некоторые штаммы из этой зоны несут типичную плазмиду с молекулярной массой 65 МДа. По имеющимся данным [5, 6], происхождение этой видоспецифической плазмиды чумного микроба связано с плазмидой, типичной для S. enterica серовар typhi, которая в ходе микроэволюционных перестроек превратилась в чумную.

При сравнении последовательностей нуклеотидов плазмиды pFra штамма Pestoides G 8786 (подвид caucasica) с подобными у плазмид типовых для основного подвида Y. pestis штаммов в ней обнаружены 2 дополнительных больших области кодирования [7]. Область 1 содержит 3 открытые рамки считывания (CDS38-40) с высоким уровнем подобия некоторым генам плазмиды pHCM2 от S.enterica серовар typhi штамма CT18 [5, 6] которые отвечают за синтез α- и β-субъединиц рибонуклеозид-дифосфатредуктазы и неизвестного белка. Область 2 локализована между ymt (гены мышиного токсина) и caf (гены антигена Caf1) детерминантами и содержит большую группу генов, гомологичных локализованным в tra-оперонах F- и R-плазмид некоторых энтеробактерий.

Пока нет данных о том, насколько эти факты, обнаруженные в разных лабораториях на нескольких штаммах, закономерны для всех рамнозопозитивных штаммов Y. pestis. Выяснение этих закономерностей позволит уточнить генотипические различия групп штаммов вида Y. pestis и предложить эффективный и быстрый прием внутривидовой дифференциации штаммов основного и неосновных подвидов. Определение штаммов возбудителя чумы к основному или к одному из неосновных подвидов может также характеризовать эпидемическую значимость этих штаммов для человека. Штаммы основного подвида являются эпидемически значимыми, а неосновных подвидов - эпидемически не значимыми [8].

Цель работы - определение наличия ряда генетических маркеров штаммов неосновных подвидов возбудителя чумы, таких как гены tra-оперона и области 1 в рFrа/Tox плазмидах, делеции в гене araC и возможность с их помощью проводить внутривидовую дифференциацию Y. pestis и идентификацию отдельных подвидов.

Материал и методы

В работе была использована коллекция, включающая 82 штамма Y. pestis, выделенных в различных природных очагах чумы, 9 штаммов Y. pseudotubercuiosis различных сероваров, 3 штамма Y. enterocoiitica, 5 штаммов E. coli, 4 из которых содержали в своем геноме последовательности различных tra-оперонов. Среди штаммов возбудителя чумы - 38 основного подвида (Rha^-) и 44 - Y. pestis неосновных подвидов (Rha+), выделенных в различных мезо-очагах Кавказа, Монголии, Горного Алтая и Памира. Изучены также полученные в ходе исследований 5 изогенных штаммов неосновного подвида (4 ssp. caucasica и 1 ssp. aitaica), у которых отсутствовала плазмида pFra. Изогенные штаммы были отобраны путем анализа клонов исследуемых штаммов на наличие плазмидной ДНК. Клоны получали при высеве штаммов на плотный (1,5%) агар LB (Difco, США) после длительного хранения на полужидком (0,7%) агаре LB в условиях холодильника (4-8 °C).

Характеристика штаммов представлена в табл. 1.

Для генотипирования применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами, представленными в табл. 2. Подготовку проб и обеззараживание тестируемых штаммов проводили согласно методическим указаниям МУ 1.3.2569-09 [9]. Идентификацию штаммов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза осуществляли с использованием праймеров, рекомендованных МУК 4.2.2940-11 (тестсистема "ГенПест"), а также праймеров vLm12for/ISrev216 и JSв составе ранее предложенного набора реагентов для идентификации штаммов возбудителя чумы [10-12]. Праймеры, комплементарные генам tra-оперона и области 1 плазмиды pFra (traA, traP, traH, copB/tapA, finO, cds39, cds40) были сконструированы на основе сиквенса плазмиды G 8786 из одноименного штамма Y. pestis. Сохранение протяженности гена araC арабинозного оперона выявляли праймерами "ypo2258" [13]. Амплификацию ДНК с праймерами "vLm12for/ISrev216", "traA", "cds39", "JS" проводили в режиме: первый этап при 94 °С - 5 мин, далее -30 циклов, состоящих из следующих этапов: 94 °С - 15 с, 65 °С - 15 с, 72 °С - 30 с, третий этап 72 °С - 5 мин; с праймерами "cds40", "traP", "traH", "finO", "copB/tapA": первый этап 94 °С - 5 мин, далее следуют 30 циклов, состоящих из шагов: 94 °С - 15 с, 58 °С - 15 с, 72 °С - 30 с, третий этап 72 °С - 5 мин; с праймерами, предложенными в других исследованиях, условия постановки ПЦР соответствовали рекомендациям авторов.

Для постановки ПЦР с учетом результатов в электрофорезе и реальном времени использовали стандартные наборы реактивов производства "Интерлабсервис" (Россия). Реакционная смесь для постановки ПЦР в варианте учета результатов с помощью электрофореза имела объем 25 мкл и содержала: 1х (однократный) ПЦР-буфер; MgCL₂ - 2 ммоль; dNTP mix - 0,4 ммоль; праймер 1 - 1-2 пмоль; праймер 2 - 1-2 пмоль; TaqDNA полимераза - 1 ед.; исследуемая ДНК - 5 мкл; воды деионизованной до 25 мкл. Реакционная смесь для постановки ПЦР в варианте учета результатов в реальном времени имела объем 35 мкл и содержала: 1х (однократный) ПЦР буфер; MgCL₂ - 1,5 ммоль; dNTP mix - 0,4 ммоль; праймер 1 - 1-2 пмоль; праймер 2 - 1-2 пмоль; зонд - 5-7 пмоль; TaqDNA полимераза - 2 ед.; исследуемая ДНК - 5 мкл; воды деионизованной до 35 мкл. Коммерческие наборы реагентов использовали согласно рекомендациям производителей.

ПЦР проводили в амплификаторах "Терцик" (ДНК-технология, Россия; для большинства праймеров) и "ДТ-Lite" (ДНК-технология, Россия; для праймеров aLt и cds39z). Учет результатов при электрофоретическом разделении ампли-фицированных фрагментов ДНК проводили в 2% агарозных гелях с использованием трис-ацетатного буфера.

Изогенные штаммы с утраченной плазмидой pFra отбирали при поклональном анализе с помощью скрининга плазмид методом Kado [14] и электрофоретического анализа выделенной ДНК в 0,7% агарозном геле с окраской этидий бромидом (Amresco, США). Отобранные штаммы проверяли в ПЦР на наличие фрагментов плазмидной ДНК с помощью набора реагентов "ГенПест" ("Микроб", Саратов, Россия)

Результаты и обсуждение

Изученные рамнозопозитивные штаммы Y. pestis из Закавказья, которые были выделены в 3 раздельных поле-вочьих мезоочагах: Ленинаканский (Армения), Зангезуро-Карабахский (Азербайджан) и Кокмандагский (Дагестан), в ПЦР со всеми праймерами, комплементарными ДНК pFra, показали следующие результаты: с помощью праймеров cds39, cds40, traА, traР и traН определена продукция специфических по длине амплификатов во всех случаях, если присутствовали определяемые последовательности ДНК. Этот результат свидетельствовал о наличии в штаммах подвида caucasica как фрагментов ДНК "области 1", комплементарных "cds39" и "cds40", так и последовательностей tra-оперона (см. табл. 1). Положительная реакция с праймерами "traА", "traР" и "traН", мишени которых расположены на обоих концах и в середине tra-оперона, позволяла предположить наличие в pFra плазмиде закавказских поле-вочьих штаммов Y. pestis значительной его части. В ряде штаммов не были получены положительные результаты с праймерами "copB/tapA" или "finO", что могло свидетельствовать о мутациях в данных участках плазмидной ДНК. Однако другие праймеры, комплементарные генам tra-оперона в этих штаммах, имели свои мишени.

ДНК штаммов, выделенных в очагах Азиатского материка и в соответствии с их характеристикой, отнесенных к подвидам hissarica, aitaica, uiegeica и taiassica, не реагировали ни с одним из праймеров, выявляющих гены tra-оперона (см. табл. 1), но давали специфическую положительную реакцию с праймерами "cds39" и "cds40", что выражалось появлением специфических по длине фрагментов амплификации. Для подтверждения того, что праймеры "cds39" и "cds40" выявляют комплементарные последовательности, находящиеся в плазмиде pFra исследованных штаммов, был полу-чен изогенный вариант одного из штаммов подвида altaica (Y. pestisИ-126), у которого отсутствовала плазмида pFra. С ДНК этого штамма праймеры cds39 и cds40 не взаимодействовали. Подобные изогены получены и при элиминировании плазмиды pFra из нескольких штаммов, относящихся к подвиду caucasica (Y. Pestis 336 Fra-, 377 Fra-, 564 Fra-, С-500 Fra-). Результаты ПЦР-анализа ДНК этих штаммов с праймерами cds39 - cds40 а также traA, traH, traP подтвердили вывод о том, что перечисленные праймеры реагируют только с ДНК плазмид этих штаммов.

Обнаруженные отличия при изучении tra-оперона у штаммов возбудителя чумы подтверждают свидетельства, послужившие основой для выделения полевочьих штаммов из Закавказья в особую полевочью разновидность [1] или подвид caucasica.Эти штаммы, наиболее близкие по свойствам к Y. pseudotubercuiosis, отличаются по многим признакам не только от классических штаммов возбудителя чумы, но и от штаммов других неосновных подвидов.

Следует также отметить, что такие штаммы, как Y. pestis Angola и Microtus str. 91001, Pestoides B, Pestoides G и другие штаммы неосновных подвидов, полный сиквенс которых имеется в доступных базах данных, содержат в составе плазмид pFra комплементарные праймерам cds39 последовательности и могут быть также детектированы этими праймерами. Согласно данным, полученным c помощью программы Blast, последовательности, комплементарные праймерам traA, помимо штаммов, ранее упоминавшихся в работе, представлены в плазмидной ДНК других штаммов, относящихся к подвиду caucasica. Интересно также отметить, что сравнительный анализ последовательностей области 1 плазмиды pFra штаммов неосновного подвида и других последовательностей из базы данных GenBank с помощью Blast позволил обнаружить сальмонеллезный фаг - Salmonella phage SSU5 (GenBank: JQ965645.1), имеющий в своем составе гомологичные области. Авторы, описавшие этот фаг, предполагают, что он является филогенетическим предшественником плазмиды pHCM2 из S.typhi CT18 [15], которая, в свою очередь, связана с образованием плазмиды pFra штаммов Y. pestis неосновных подвидов. Следует также обратить внимание на то, что все штаммы неосновных подвидов в проведенном исследовании имели в составе генома нуклеотидную последовательность области 1, которая отсутствовала у штаммов основного подвида. Это может свидетельствовать о том, что либо генетический маркер этих штаммов (область 1) был получен клоном, предшественником всех Pestoides после ответвления от основного ствола филогенетического дерева, на котором в дальнейшем появились клоны, относящиеся к основному подвиду, либо этот маркер изначально присутствовал у общего предка, а потом у клона предшественника всех штаммов основного подвида был утрачен.

Представленные результаты позволяют рекомендовать использование специфических участков плазмидной ДНК в качестве мишеней для выявления штаммов неосновных подвидов и их дифференциации от штаммов основного подвида. С целью идентификации штаммов неосновного подвида предложено использовать праймеры cds39, а для выявления штаммов ssp. caucasica - traA.

Алгоритм применения набора праймеров в ПЦР (см. рисунок) предполагает на первом этапе исследования идентификацию возбудителя чумы и его дифференциацию от близкородственного возбудителя псевдотуберкулеза с помощью набора праймеров vlm12for/ISrev216 и JS, предложенного для этих целей ранее [12, 16]. Следующим этапом является внутривидовая дифференциация на штаммы основного и неосновных подвидов с помощью праймеров cds39. Штаммы неосновных подвидов на следующем этапе могут быть исследованы дополнительно для определения их позиции внутри этой группы с помощью праймеров traA и ypo2258. Праймеры ypo2258 используют для выявления делеции 112 пар нуклеотидов в гене araC,что является одним из отличительных признаков штаммов, выделенных в Китае [13, 17]. Тестирование всех штаммов неосновных подвидов, имеющихся в коллекции, с праймерами ypo2258 в ПЦР позволило выявить 4 штамма, ранее идентифицированные как подвид altaica Y. pestis (И-126, 2420, 2563, 436), выделенных не в Китае, а в Монголии, но имеющие ранее описанную делецию в гене araC. Эти штаммы можно было бы по этому признаку отнести к группе неосновных подвидов, сходных с китайскими.

Представленный алгоритм позволяет на любом этапе лабораторного исследования материала, подозрительного на наличие Y. pestis, оперативно, без привлечения сложных приборов и дорогостоящих методов, с минимальными затратами получить важный для эпидемиологического анализа ответ: относится ли выделенный штамм к основному подвиду - потенциально эпидемически опасному либо его можно причислить к неосновным подвидам - эпидемически не опасным.

Существующий алгоритм генетического исследования и внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis предназначен в основном для его использования на более поздних этапах лабораторного исследования, так как требует

Алгоритм применения набора праймеров в полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителя чумы более сложного оборудования и квалифицированного персонала [18]. Хотя отдельные методические приемы, используемые в этом алгоритме, а именно дифференциация на основной и неосновные подвиды, могут быть применены также на ранних этапах исследования.

В ходе проведенного исследования были дополнительно сконструированы пары праймеров aLtfor/aLtrev и cds39zfor/cds39zrev, а также соответствующие им флуоресцентно меченные зонды, которые комплементарны мишеням для праймеров vLm12for/ISrev216 и cds39, позволяющие проводить оперативную идентификацию и внутривидовую дифференциацию Y. pestis в ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Результаты ПЦР с этими наборами реагентов не отличались от таковых, полученных при использовании метода электрофорезного разделения амплифицированных фрагментов. Установлено, что предложенные праймеры и зонды специфичны и могут быть использованы для идентификации штаммов возбудителя чумы и их внутривидовой дифференциации (см. табл. 1).

Таким образом, на значительном числе штаммов неосновных подвидов Y. pestis подтверждено присутствие в их геноме уникальных областей, которых нет у основного подвида. Скрининг области 1 Y. pestis показал ее наличие только в ДНК штаммов неосновных подвидов. Присутствие области 2 с генами tra-оперона было подтверждено только у штаммов Y. pestis ssp. caucasica. Не все гены tra-оперона стабильно выявляются в штаммах возбудителя чумы, однако такие как traA, traH, traP были определены у всех штаммов Y. pestis ssp. caucasica. На основании выявленных генетических маркеров предложен алгоритм идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis. Описанная выше дифференциация штаммов, прежде всего по стабильным структурным особенностям видоспецифической плазмиды Y. pestis, помогает в оценке степени их эпидемической опасности и в выборе мероприятий в рамках эпидемиологического надзора за чумой в различных по активности очагах.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Леви М.И., Канатов Ю.В., Сагатовская Л.А., Канатова Е.А. Новая разновидность чумного микроба // Тр. Ростовск. н/Д н. противочум. Ин-та. 1961. № 18. С. 3-23.

2. Гончарова Н.А., Иванова В.С., Лебедева С.А., Заренков М.И. Генетический анализ высокомолекулярных плазмид полевочьих штаммов чумного микроба // Эпидемиол., микробиол., иммунол. бактер. и вирус. инф. Ростов н/Д, 1989. С. 145-147.

3. Иванова В.С., Лебедева С.А., Гончарова Н.А., Гурлева Г.Г. Скрининг плазмид у музейных штаммов чумного микроба, выделенных из разных природных очагов // Молекул. генетика. 1990. № 3. С. 16-18.

4. Филиппов А.А., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов // Журн. микробиол. 1992. № 3. С. 10-13.

5. Hu P., Elliot J., McCready P., Skowronski E. et al. Structural organization of virulence-associated plasmids of Yersinia pestis // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 5192-5202.

6. Linder E., Plano G.V., Burland V., Mayhew G.F. et al. Complete DNA sequence and detailed analysis of the Yersinia pestis // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, N 12. P. 5731-5742.

7. Golubov A., Neubauer H., Nolting Ch., Heesemann J. et al. Structural organization of the pFra virulence-asociated plasmid of rhamnose-positive Yersinia pestis // Infect. Immun. 2004. Vol. 72, N 10. P 1-9.

8. Кокушкин А.М. Социально-биологические аспекты эпидемиологии чумы : автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Саратов; 1995.

9. МУ 1.3.2569-09 "Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

10. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M., Hu P et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase (glpD) // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, N 4. P 10191027.

11. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P.M., Worsham P.L. et al. Identification on nucleotide sequences of the specific and rapid detection of Yersinia pestis // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, N 8. P 37593762.

12. Трухачев А.Л., Иванова В.С., Арсеньева Т.Е., Лебедева С.А. и др. Поиск праймеров на основе хромосомной ДНК Yersinia pestis для наиболее эффективной ПЦР - идентификации типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы // Клин. лаб. диагностика. 2008. № 12. С. 49-52.

13. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y. et al. Genetics of metabolic variants between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar microtus // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, N 15. P 5147-5152.

14. Kado C.J., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981. Vol. 145, N 3. P. 13651373.

15. Kim M., Kim S., Ryu S. Complete Genome Sequence of Bacteriophage SSU5 Specific for Salmonella enterica serovar Typhimurium rough strains // J. Virol. 2012. Vol. 86, N 19. Article ID 10894.

16. Трухачев А.Л., Лебедева С.А., Васильева Е.А., Иванова В.С. и др. Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis. Пат. № 2404251. С1 МПК d2Q 1/00. Изобретение, заявка № 2009116579/10 от 29.04.2009 г. Опубл.: 20.11.2010. Бюл. № 32, 12 с.

17. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М. и др. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов Yersinia pestis различного происхождения // Мол. генетика. 2009. № 3. С. 21-25.

18. Ерошенко ГА., Одиноков ГН., Куклева Л.М., Павлова А.И. и др. Стандартный алгоритм молекулярного типирования штаммов Yersinia pestis // Журн. микробиол.. 2012. № 3. С. 25-35.

References

1. Levi M.I., Kanatov Yu.V., Sagatovskaya L.A., Kanatova E.A. New species of the plague microbe. In: Proceedings of the Rostov-on-Don AntiPlague Institute. 1961; (18): 3-23. (in Russian)

2. Goncharova N.A., Ivanova V.S., Lebedeva S.A., Zarenkov M.I. Genetic analysis of macromolecular plasmids of vegetational strains of the plague bacteria. In: Epidemiology, microbiology, immunology of bacterial and viral infections. Rostov-on-Don, 1989: 145-7. (in Russian)

3. Ivanova V.S., Lebedeva S.A., Goncharova N.A., Gurleva G.G. Plasmid screening in archival strains of the plague microbe isolated from various natural foci. Molecular Genetics [Molekulyarnaya genetika]. 1990; (3): 16-8. (in Russian)

4. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kukleva L.M., Protsenko O.A. Study of the plasmid composition of plague pathogen strains from various natural foci. Zhurnal mikrobiologii [Journal of Microbiology]. 1992; (3): 10-3. (in Russian)

5. Hu P., Elliot J., McCready P., Skowronski E., et al. Structural organization of virulence-associated plasmids of Yersinia pestis. J Bacteriol. 1998; 180: 5192-202.

6. Linder E., Plano G.V., Burland V., Mayhew G.F., et al. Complete DNA sequence and detailed analysis of the Yersinia pestis. Infect Immun. 1998; 66 (12): 5731-42.

7. Golubov A., Neubauer H., Nolting Ch., Heesemann J., et al. Structural organization of the pFra virulence-asociated plasmid of rhamnose-positive Yersinia pestis. Infect Immun. 2004; 72 (10): 1-9.

8. Kokushkin A.M. Socio-biological aspects of the epidemiology of plague: Autobstract of Diss. Saratov; 1995. (in Russian)

9. Organization of laboratories using nucleic acid amplification methods for the work with materials containing microorganisms I-IV pathogenicity groups, MU 1.3.2569-09. (in Russian)

10. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M., Hu P., et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase (glpD). J Bacteriol. 2002; 184 (4): 1019-27.

11. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P.M., Worsham P.L., et al. Identification on nucleotide sequences of the specific and rapid detection of Yersinia pestis. Appl Environ Microbiol. 2001; 67 (8): 3759-62.

12. Trukhachev A.L., Ivanova V.S., Arsen'eva T.E., Lebedeva S.A., et al. Search for primers on the basis of Yersinia pestis chromosomal DNA for effective PCR identification of typical and atypical plague pathogen strains. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics Journal]. 2008; (12): 49-52. (in Russian)

13. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., et al. Genetics of metabolic variants between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar microtus. J Bacteriol. 2004; 186; 15: 5147-52.

14. Kado C.J., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol. 1981; 145 (3): 1365-73.

15. Kim M., Kim S., Ryu S. Complete Genome Sequence of Bacteriophage SSU5 Specific for Salmonella enterica serovar Typhimurium rough strains. J Virol. 2012; 86 (19): 10894.

16. Trukhachev A.L., Lebedeva S.A., Vasilieva E.A., Ivanova V.S., et al. Yersinia pestis strains identification and intragroup differentiation method. Pat. No. 2404251. C1 IPC S12Q 1/00. Invention, application number 2009116579/10 dated 04.29.2009. Publ.: 20.11.2010. Bul. No. 32: 12 p. (in Russian)

17. Eroshenko G.A., Vidyaeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., et al. Structural and functional analysis of araC gene in Yersinia pestis of various origins. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2009; (3): 21-5. (in Russian)

18. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Pavlova A.I., et al. Standard algorithm of molecular typing of Yersinia pestis strains. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2012; (3): 25-35. (in Russian)

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)