Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, выделенных на территории Республики Крым в 2015-2017 гг.

• Анна Сергеевна Волынкина
• Котенев Егор Сергеевич
• Лисицкая Яна Владимировна
• Тихонов Сергей Николаевич
• Куличенко Александр Николаевич

Резюме

В июне 2017 г. зарегистрирован первый с 1967 г. случай крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в Республике Крым. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследовано 183 пула иксодовых клещей, собранных при проведении эпизоотологического обследования 5 административных районов Республики Крым, в 29 (15,9%) пулах обнаружена РНК вируса Крым-Конго (КК).

Цели работы - молекулярно-генетическая характеристика РНК-изолятов вируса КК, выявленных в образцах клинического и полевого материала, полученных в Крыму в 2017 г., и сравнительный анализ генетических вариантов вируса КК, циркулировавших на территории Республики Крым в 2015-2017 гг.

Материал и методы. Исследованы 1 проба крови больного КГЛ, выявленного в 2017 г. в Республике Крым, и 29 пулов иксодовых клещей, положительных на наличие РНК вируса КК, собранных в 2017 г. в Черноморском и Ленинском административных районах Республики Крым. Генетическую идентификацию вируса КК осуществляли методом секвенирования фрагментов S-, M- и L-сегментов генома вируса. Филогенетический анализ проводили в программе Mega 5.05 методом Neighboor joining, по алгоритму Kimura-2.

Результаты. Определена нуклеотидная последовательность фрагментов S-, M- и L-сегментов генома РНК-изолятов вируса КК, выявленных в образце сыворотки крови больного КГЛ и в 6 пробах суспензий клещей с достаточной вирусной нагрузкой. В результате секвенирования фрагментов генома РНК-изолятов вируса КК установлено, что в 2017 г. в Республике Крым одновременно циркулировали изоляты вируса КК генотипа "Европа-1", принадлежащие к субтипам Va "Ставрополь-Ростов-Астрахань" и Vd "Крым". В 2015 г. в Крыму были выявлены только штаммы субтипа Vd. Субтип Vd "Крым" является эндемичным генетическим вариантом вируса КК для Крымского полуострова. РНК-изоляты вируса КК субтипа Va "Ставрополь-Ростов-Астрахань" ранее на территории Республики Крым не выявляли. Появление в 2017 г. на территории Крыма штаммов вируса КК субтипа Va, возможно, связано с заносом инфицированных вирусом КК клещей, при транспортировке крупного и мелкого рогатого скота в Крым с территории субъектов юга России, энзоотичных по КГЛ. Для оценки генетической гетерогенности популяции вируса КК в Республике Крым и выявления закономерностей распределения генетических вариантов необходимо дальнейшее проведение молекулярно-генетических исследований штаммов и РНК-изолятов вируса КК, выявляемых на территории Республики Крым.

Ключевые слова:Крымская-Конго геморрагическая лихорадка, молекулярная эпидемиология, филогенетический анализ, Республика Крым

Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - особо опасная природно-очаговая вирусная инфекция, эндемичная для стран Африки, Азии, Юго-Восточной Европы и территорий юга европейской части России, характеризующаяся спорадической заболеваемостью с возникновением периодических вспышек и уровнем летальности 4-30% [1]. Этиологическим агентом КГЛ является вирус Крым-Конго (КК), принадлежащий к роду Orthonairovirus семейства Nairoviridae порядка Bunyavirales [2].

Впервые КГЛ была описана как вспышка лихорадочного заболевания с клинической картиной острого капилляротоксикоза среди солдат Красной армии и гражданского населения, проходившей летом 1944 г. в северо-западной части Крыма. В течение 1944 г. в Крыму было зарегистрировано около 200 случаев заболевания КГЛ, летальность составила 8%, болели люди, работавшие или ночевавшие в степи, большинство из них в анамнезе отмечали присасывание клещей [3]. С 1945 по 1965 г. на территории Республики Крым ежегодно регистрировали заболеваемость КГЛ (от 1 до 27 случаев в год).

С 1967 г. по 2016 г. случаев КГЛ среди местных жителей Республики Крым не выявлено, однако отмечали случаи заражения вирусом КК туристов, находившихся на отдыхе в Крыму. В 2013 г. зарегистрирован случай завоза КГЛ из Крыма в Москву (место заражения неизвестно) [1]. В 2015 г. зарегистрирован завоз КГЛ из Крыма в Воронежскую область (место заражения - окрестности с. Лучистое Алуштинского района) [4]. В июне 2017 г. зарегистрирован первый с 1967 г. случай заболевания КГЛ в Республике Крым.

Изучение природных очагов КГЛ в Крыму вновь началось с 2014 г. В 2015 г. при исследовании иксодовых клещей Hyalomma marginatum, снятых с животных, РНК вируса КК выявлена в 2,0% пулов клещей. Циркуляция вируса КК установлена в степной зоне (Красноперекопский, Красногвардейский, Джанкойский и Ленинский районы) и горнолесной зоне (Алуштинский район) Республики. В результате эпизоотологического обследования в 2017 г. установлена циркуляция вируса КК в Черноморском и Ленинском районах Республики Крым. В 2014 и 2016 гг. пулов иксодовых клещей, положительных на наличие РНК вируса КК, не выявлено.

Вирус КК является одним из наиболее генетически разнообразных среди арбовирусов. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК негативной полярности, состоит из трех сегментов: малого (S), среднего (М) и большого (L) [5, 6]. На основании частичных и полных нуклеотидных последовательностей S-, M- и L-сегментов генома вируса КК выделяют 6-9 генетических линий вируса, имеющих корреляцию с географическим местом выделения: "Африка-1" (I), "Африка-2" (II), "Африка-3" (III), "Азия-1" (IVa), "Азия-2" (IVb), "Азия-3", "Европа-1" (V), "Европа-2" (VI), "Европа-3" (VII), "Мавритания" [5, 7, 8].

На юге России преобладают штаммы вируса КК генотипа "Европа-1", циркулирующие также в Турции, странах Балканского полуострова и Иране [9, 10]. В пределах генотипа "Европа-1" выделяется несколько субтипов: российские штаммы вируса КК, принадлежат к субтипам "Ставрополь-Ростов-Астрахань" (Va), "Волгоград-Ростов-Ставрополь" (Vb), "Астрахань-2" (Vc) [9].

Молекулярно-генетические исследования РНК-изолятов вируса КК, выявленных в пробе клинического материала от больного КГЛ в 2015 г., инфицирование которого вирусом КК произошло во время отдыха в Крыму, и в образцах полевого материала, собранного на территории Республики Крым, показали принадлежность их к отдельному субтипу "Крым" (Vd) в пределах генотипа "Европа-1" [4].

Цели работы - молекулярно-генетическая характеристика РНК-изолятов вируса КК, выявленных в образцах клинического и полевого материала, полученных в Крыму в 2017 г., и сравнительный анализ генетических вариантов вируса КК, циркулировавших на территории Республики Крым в 2015-2017 гг.

Материал и методы

Материал для исследования: сыворотка крови больного КГЛ, выявленного в июне 2017 г. в Ленинском районе Республики Крым; 29 пулов иксодовых клещей видов H. marginatum, Haemaphysalis punctata, Rhipicephalus sanguineus, R. bursa, положительных на наличие РНК вируса КК, которые были собраны в 2017 г. с КРС и МРС в Черноморском и Ленинском районах Республики Крым. Образцы полевого и клинического материала хранили при температуре -70 °C.

Индикация РНК вируса КГЛ в материале. Индикацию вируса КК в клиническом материале и пулах клещей осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора реагентов для выявления РНК вируса КК "АмплиСенс® CCHFV-FL" (ООО "ИнтерЛабСервис", Россия), согласно инструкции производителя. Экстракцию РНК из образцов клинического и полевого материала и получение комплементарной ДНК выполняли с помощью наборов реагентов "РИБО-преп" и "РЕВЕРТАФ-100" (ООО "ИнтерЛабСервис", Россия).

Секвенирование ПЦР-фрагментов. Генетическую идентификацию вируса КК проводили методом секвенирования 3 участков генома вируса: фрагмента 115-652, кодирующего области малого (S) сегмента генома (538 п.о.); фрагмента 4620-5075, кодирующего области среднего (М) сегмента генома (435 п.о.) и фрагмента 105-541, кодирующего области большого (L) сегмента генома (437 п.о.) с последующим филогенетическим анализом (позиции фрагментов приводятся по полноразмерным последовательностям S-, M- и L-сегментов генома штамма ROS/HUVLV-100, GenBank DQ206447, DQ206448, AY995166 соответственно). ПЦР-продукты получали с использованием праймеров: S-100f и S-680r [9], 24 и 25 [11], L-100f: gattggactcaggtgattgctggtc и L-540r: gcctccctcgtgtctgtttc. При постановке реакции секвенирования использовали праймер L-100-1f: faccgtaggttcaatatctc(c/t)gatta вместо праймера L-100f. Определение нуклеотидных последовательностей выполняли на автоматическом секвенаторе ABI 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США) с набором реагентов Big Dye Terminator Kit v.3.1.

Филогенетический анализ: нуклеотидные последовательности фрагментов и сегментов генома изолятов вируса КК, полученные в данной работе, сравнивали с имеющимися последовательностями штаммов вируса, полученными из базы данных GenBank. Анализ уровня генетического родства и построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 5.05 с использованием метода Neighboor joining, по алгоритму Kimura-2, статистическую достоверность топологии филогенетических деревьев проверяли с помощью Bootstrap-анализа, вычисления проводили для 1000 повторов.

Результаты и обсуждение

В июне 2017 г. в с. Вулкановка Ленинского района Республики Крым зарегистрирован случай заболевания КГЛ. Больной, 31 год, безработный, имеет подсобное хозяйство (КРС, МЛС). Заболел 30 мая 2017 г. с появления резкой головной боли, повышения температуры тела до 39 °С, боли в горле, мышцах, крупных суставах, выраженной слабости. Госпитализирован в инфекционное отделение центральной районной больницы с диагнозом "катаральная ангина, гипертермический синдром". На 5-й день болезни поставлен диагноз "лихорадка неясной этиологии", с целью его уточнения осуществлен забор крови. В результате лабораторного исследования методом ПЦР в сыворотке крови больного выявлена РНК вируса КК, поставлен диагноз "Крымская геморрагическая лихорадка, среднетяжелое течение", без выраженного геморрагического синдрома. На 6-й день болезни состояние больного оставалось стабильным, геморрагический синдром отсутствовал, от начала лечения отмечалась положительная динамика.

По данным эпидемиологического анамнеза установлено, что на личном подворье заболевшего содержится 500 голов овец, 20 голов коров, 20 кур, 3 собаки. Больной связывает заболевание с раздавливанием клещей незащищенными руками при стрижке овец 23-28 мая 2017 г. Присасывание клещей и контакт с лихорадящими больными отрицает.

По факту регистрации подтвержденного случая КГЛ в селе 5 июня 2017 г. было проведено экстренное эпизоотологическое расследование. При проведении эпизоотологического обследования осуществлен сбор иксодовых клещей со скота на домашнем подворье, на пастбище и на флаг с близлежащей территории. Установлено наличие клещей H. marginatum, H. punctata, R. sanguineus, R. bursa на КРС и МРС и R. sanguineus на собаках. В результате исследования методом ПЦР 42 пулов (233 особи) клещей, собранных в Ленинском районе Республики Крым, РНК вируса КК выявлена в 21 пробе суспензий клещей видов H. marginatum, H. punctata, R. sanguineus и R. bursa.

При проведении планового эпизоотологического мониторинга территории Республики Крым в 2017 г. обследована территория Судакского, Алуштинского, Симферопольского и Черноморского районов, осуществлен сбор иксодовых клещей для лабораторного исследования на наличие маркеров вируса КК. В результате ПЦР анализа 141 пула клещей РНК вируса КК обнаружена в 8 пробах суспензий клещей видов H. marginatum и H. punctata, собранных с МРС в Черноморском районе Республики Крым (окрестности с. Красносельское).

Для оценки генетической гетерогенности вариантов вируса КК, циркулировавших на территории Республики Крым в 2017 г., проведено молекулярно-генетическое типирование РНК-изолятов вируса КК из образцов полевого и клинического материала.

Определена нуклеотидная последовательность фрагментов S-, M- и L-сегментов генома РНК-изолятов вируса КК, выявленных в образце плазмы крови больного КГЛ (№ 827, РНК-изолят 827-CRIMEA/HU-2017) и 6 пробах суспензий клещей с достаточной вирусной нагрузкой (суспензии клещей № 723, 724, 728, 730 H. marginatim, снятых с МРС), собранных в окрестностях с. Красносельское Черноморского района (РНК-изоляты 723-CRIMEA/TI-2017, 724-CRIMEA/TI-2017, 728-CRIMEA/TI-2017, 730-CRIM EA/TI-2017); суспензии клещей № 840, 860 H. marginatim, снятых с КРС, собранных в окрестностях с. Вуклановка Ленинского района (РНК-изоляты 840-CRIMEA/TI-2017, 860-CRIMEA/TI-2017).

Секвенированные последовательности фрагментов S-, M- и L-сегментов генома РНК-изолятов вируса КК, полученные в данном исследовании, и геномные последовательности штаммов, относящихся к разным генотипам вируса КК, содержащиеся в базе данных GenBank, использовали для проведения филогенетического анализа. В анализ также были включены секвенированные ранее нуклеотидные последовательности РНК-изолятов вируса КК: 1-CRIMEA/HU-2015 выделен из пробы клинического материала от больной КГЛ, инфицирование которой вирусом КК произошло на отдыхе в Крыму в 2015 г.; 1193-CRIMEA/TI-2015, 1231-CRIMEA/ TI-2015, 1237-CRIMEA/TI-2015 выявлены в образцах суспензий иксодовых клещей H. marginatum и R. bursa, собранных в окрестностях с. Лучистое Алуштинского района в 2015 г. [4]. Генотип/субтип РНК-изолятов вируса КК, определяли на основании сравнения кластерной позиции образца при проведении филогенетического анализа по фрагментам 3 сегментов (S, M и L) генома вируса.

При проведении филогенетического анализа по фрагментам S-, M- и L-сегментов генома вируса установлено, что исследуемые образцы принадлежали к генотипу "Европа-1" (V), к которому также относятся штаммы, циркулирующие на юге европейской части России, Турции, Юго-Восточной Европы, и единичные изоляты из Ирана.

На филогенетических деревьях, построенных по фрагментам S-, M- и L-сегментов генома (см. рисунок, A, Б, В) в пределах генотипа "Европа-1" выделяют 6 генетических подгрупп: "Ставрополь-Ростов-Астрахань" (Va), "Волго-град-Ростов-Ставрополь" (Vb), "Астрахань-2" (Vc не выделяется на филогенетическом дереве по M-сегменту), "Крым" (Vd), подгруппы турецких и балканских штаммов.

Исследуемые РНК-изоляты вируса КК на филогенетических деревьях по фрагментам S-, M- и L-сегментов отнесены к 2 генетическим подгруппам генотипа "Европа-1": "Ставрополь-Ростов-Астрахань" (Va) и "Крым" (Vd).

РНК-изолят вируса КК 827-CRIMEA/HU-2017 из образца сыворотки крови больного КГЛ, выявленного в с. Вулкановка Ленинского района, и изоляты 723-CRIMEA/TI-2017, 724-CRIM EA/TI-2017, 728-CRIMEA/TI-2017, 730-CRIMEA/ TI-2017 - из 4 пулов клещей H. marginatum, собранных в окрестностях с. Красносельское Черноморского района, совпадали со штаммами генетической подгруппы "Ставрополь-Ростов-Астрахань" Va.

РНК-изоляты вируса КК 840-CRIMEA/TI-2017, 860-CRIMEA/TI-2017, выявленные в 2 пробах суспензий клещей H. marginatum, собранных в окрестностях с. Вулкановка Ленинского района Республики Крым, входили в подгруппу "Крым" Vd, образованную выделенными в 2015 г. на территории Республики Крым РНК-изолятами вируса 1-CRIMEA/ HU-2015, 1193-CRIMEA/TI-2015, 1231-CRIMEA/TI-2015, 1237-CRIMEA/TI-2015.

Таким образом, в результате секвенирования фрагментов генома вариантов вируса КК в образцах клинического и полевого материала установлено, что в 2017 г. в Республике Крым одновременно циркулировали изоляты вируса КК генотипа "Европа-1", принадлежащие к субтипам Va (S-Va; M-Va; L-Va) - "Ставрополь-Ростов-Астрахань" и Vd (S-Vd; M-Vd; L-Vd) "Крым". В 2015 г. в Крыму установлена циркуляция только штаммов субтипа Vd.

Субтип Vd (S-Vd; M-Vd; L-Vd) "Крым" является эндемичным генетическим вариантом вируса КК для Крымского полуострова, изоляты данного субтипа впервые были обнаружены в образце сыворотки крови больной КГЛ, зарегистрированной в Воронеже в 2015 г., заражение которой вирусом КК произошло на территории Республики Крым,и в 3 пробах суспензий клещей H. marginatum и R. bursa, собранных на территории Алуштинского района Республики Крым в окрестностях с. Лучистое в июле 2015 г.; они встречаются только на территории Крымского полуострова.

РНК-изоляты вируса КК субтипа Va (S-Va; M-Va; L-Va) "Ставрополь-Ростов-Астрахань" ранее на территории Республики Крым не выявляли, однако это может быть связано с недостаточным количеством охарактеризованных к настоящему времени штаммов вируса КК, изолированных в природном очаге КГЛ в Крыму. Данный генетический вариант вируса КК преобладает на территории юга России, в 2007-2016 гг. он был обнаружен в образцах полевого и клинического материала на территории Ставропольского и Краснодарского краев, Ростовской, Волгоградской, Астраханской областей, республик Дагестан и Калмыкия. Появление в 2017 г. на территории Крыма штаммов вируса КК субтипа Va, возможно, произошло в результате заноса инфицированных вирусом КК клещей при транспортировке КРС и МРС в Крым с территории субъектов юга России, энзоотичных по КГЛ.

Принадлежность к разным генетическим подгруппам изолятов вируса КК генотипа "Европа-1", детектированных в образце клинического материала от больного КГЛ из с. Вулкановка и в 2 пробах суспензий клещей, собранных на пастбище и частном подворье, может свидетельствовать как о возможном инфицировании больного в другом районе Республики, так и о циркуляции в Ленинском районе Республики Крым штаммов КК субтипа Va, не выявленных при проведении генетического типирования положительных проб суспензий иксодовых клещей в связи с низкой вирусной нагрузкой в образцах.

Для оценки генетической гетерогенности популяции вируса КК в Республике Крым и определения закономерностей распределения генетических вариантов необходимо систематическое проведение эпизоотологического мониторинга на всей территории природного очага КГЛ и дальнейшее проведение молекулярно-генетических исследований штаммов и РНК-изолятов вируса КК, циркулирующих на территории Республики Крым.

Литература

1. Смирнова CE. Крымская геморрагическая лихорадка (этиология, эпидемиология, лабораторная диагностика). М. : АТиСО, 2007. 304 с.

2. ICTV. Virus Taxonomy 2016 [Электронный ресурс]. URL: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/ (дата обращения: 13.05.2017)

3. Чумаков М.П. Новая вирусная клещевая болезнь - геморрагическая лихорадка в Крыму (острый инфекционный капилляро-токсикоз) // Крымская геморрагическая лихорадка (острый инфекционный капилляро-токсикоз). Изд. Отдельной Приморской Армии, 1945. С. 13-43.

4. Куличенко А.Н., Волынкина А.С., Котенев EX., Писаренко С.В. и др. Новый генетический вариант вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, выявленный в Крыму // Молекул. генетика. 2016. № 2. С. 38-42.

5. Bente D.A., Forrester N.L., Watts D.M., McAuley A.J. et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever: History, epidemiology, pathogenesis, clinical syndrome and genetic diversity // Antiviral Res. 2013. Vol. 100, N 1. P. 159-189. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.07.006.

6. Flick R. Molecular biology of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Crimean-Congo Hemorrhagic Fever: a Global Perspective / eds O. Ergonul, C.A. Whitehouse. Dordrecht : Springer, 2007. P. 35-44.

7. Carroll S.A., Bird B.H., Rollin P.E., Nichol S.T. Ancient common ancestry of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Mol. Phylogenet. Evol. 2010. Vol. 55, N 3. P. 1103-1110. doi: 10.1016/j.ympev.2010.01.006.

8. Hewson R. Molecular epidemiology, genomics, and phylogeny of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Crimean-Congo Hemorrhagic Fever / eds O. Ergonul, C. Whitehouse. Dordrecht : Springer, 2007. P. 45-55.

9. Волынкина А.С., Куличенко А.Н. Генетический мониторинг вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки на юге Eвропейской части России в 2011 г. // Пробл. особо опасных инфекций. 2012 № 4 (114). С. 80-85.

10. Sherifi K., Cadar D., Muji S., Robaj A. et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus clades V and VI (Europe 1 and 2) in ticks in Kosovo, 2012. // PLoS Negl. Trop. Dis. 2014. Vol. 8, N 9. Article ID e3168. doi: 10.1371/journal.pntd.0003168.

11. Kuhn J.H., Seregin S.V., Morzunov S.P., Petrova I.D. et al. Genetic Analysis of the M RNA Segment of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Strains Involved in the Recent Outbreaks in Russia // Arch. Virol. 2004. Vol. 149. P. 2199-2213. doi: 10.1007/s00705-004-0354-3.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)