Молекулярное типирование штаммов Vibrio parahaemoiyticus на основе INDEL-маркеров

• Чемисова Ольга Сергеевна
• Водопьянов Алексей Сергеевич
• Рыковская Оксана Алексеевна
• Водопьянов Сергей Олегович
• Голенищева Елена Николаевна

Резюме

Ключевые слова:Vibrio parahaemolyticus, INDEL-типирование, вибрионы, генотип, термостабильный прямой гемолизин TDH, TDH-родственный гемолизин TRH

Вибрионы широко распространены на земном шаре, они являются естественными обитателями пресных и соленых водоемов, а также гидробионтов, обитающих в них. В настоящее время известно около 91 вида вибрионов, 12 из них отнесены к патогенным для человека [1]. Среди галофильных вибрионов по частоте и тяжести вызываемых ими острых кишечных заболеваний особое место занимают парагемолитические вибрионы. Vibrio parahaemolyticus - основная причина пищевых токсикоинфекций, особенно в Японии, Юго-Восточной Азии и Приморском крае [2-4]. Опасность заражения парагемолитическими вибрионами существует везде, где население использует в питании продукты моря. Вспышки заболеваний возникают в теплое время года в основном в прибрежных районах, но могут встречаться и в местах, удаленных от побережья, что связано с завозом инфицированных продуктов.

В организм человека вибрионы попадают при употреблении в пищу сырых или недостаточно обработанных морепродуктов. Вызываемый ими острый гастроэнтерит протекает по типу пищевой токсикоинфекции (ПТИ). Основными факторами патогенности V. parahaemolyticus являются гемолизины - термостабильный прямой (TDH-thermostable direct hemolysin) и TDH родственный (TDH-related hemolysin), а также 2 контакт-зависимые системы секреции третьего типа (T3SS), особенно T3SS2, ответственная за энтеротоксичность [5-7]. Заболевания, вызываемые парагемолитическими вибрионами, могут протекать в виде одной из трех клинических форм: гастроэнтеритической, дизентерие-и холероподобной [8].

Для быстрой и точной диагностики заболеваний, вызываемых V. parahaemolyticus представляется важным совершенствование схемы изучения биологических свойств вибрионов, в том числе при использовании методов молекулярной биологии. Фундаментальные исследования в области генетики микроорганизмов в последнее десятилетие позволили расширить возможности идентификации микроорганизмов и изучения генетического разнообразия популяций. Применение молекулярных методов внутривидового типирования бактерий позволяет проводить анализ и прогнозировать распространение клонов с повышенной вирулентностью, устойчивостью к внешним факторам и антибактериальным препаратам. Одним из новых молекулярных методов является INDEL-типирование, в основе которого лежит поиск спонтанных вставок/делеций (insertion/deletion) нескольких нуклеотидов, отличающихся по длине у различных организмов. INDEL-метод с успехом применяют для генотипирования как микроорганизмов [9], так и человека [10]. А.С. Водопьяновым с соавт. разработана система INDEL-типирования Vibrio cholerae, включающая 4 гена и систему специфических праймеров [11]. Сведения об использовании INDEL-типирования для парагемолитических вибрионов в литературе не найдены.

Цель исследования - изучение с помощью метода INDEL-типирования коллекционных штаммов V. parahaemolyticus, выделенных на территории РФ.

Материал и методы

В работе использовали 100 штаммов V. parahaemolyticus, выделенных из морской воды, от гидробионтов и людей в регионах Черного, Азовского, Каспийского, Японского морей с 1972 по 2015 г. Штаммы хранились в лиофилизирован-ном состоянии в коллекции музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ "Ростовский-на-Дону противочумный институт" Роспотребнадзора.

Штаммы были представлены 4 вариантами: tdh+trh+, tdh+trh-, tdh-trh+, tdh-trh-. ПЦР со сконструированными праймерами к 6 INDEL-локусам вибрионов (см. табл.) проводили по уже описанной ранее методике [12]. Кластерный анализ и построение дендрограммы выполнены с помощью программы GeneExpert (ФКУЗ "Ростовский-на-Дону противочумный институт" Роспотребнадзора).

Результаты и обсуждение

Проведенный INDEL-анализ 100 штаммов V. parahaemolyticus позволил выявить 25 уникальных генотипов, которые распределились между 5 кластерами, обозначенными буквами латинского алфавита от A до F (рис. 1). В целом для штаммов была характерна низкая клональность - большинство генотипов было представлено одним или двумя изолятами, из 25 генотипов лишь 11 включали от 3 до 13 штаммов. Наибольшее число генотипов было характерно для штаммов, выделенных от больных людей и из морской воды. Сопоставление генотипов парагемолотических вибрионов и места их выделения не выявило четкой географической привязанности, что можно объяснить широким распространением разных штаммов по путям транспорта рыбной продукции, а также с балластными водами судов.

Патогенность возбудителя V. parahemolyticus связывают с продукцией токсинов-гемолизинов: термостабильного прямого гемолизина (Thermostable Direct Hemolysin, TDH) и TDH-родственного гемолизина (TDH-related hemolysin, TRH), кодируемых соответственно генами tdh и trh. Штаммы, содержащие ген tdh, входили в кластеры B, C и D, большинство из них относились к генотипам С9 и D1. Штаммы trh+ вошли в кластеры A, B, C. Отдельный кластер F составили штаммы, не несущие генов основных факторов патогенности, кроме того, авирулентные парагемолитические вибрионы относились к А, B и С кластерам, преимущественно к генотипам А3 и А4 (рис. 2).

Начиная с 1996 г. было выявлено, что доминирующее значение в этиологии пищевых токсикоинфекций имеют штаммы V. parahaemolyticus серогруппы О3:К6, получившие в зарубежной литературе название пандемичных [13]. Пандемичные штаммы V. parahaemolyticus, взятые в проведенное исследование отнесены к геноварианту D1, только один штамм - к варианту С6. Полученные данные подтверждают имеющееся в зарубежной литературе мнение о клональном происхождении пандемичных штаммов [13].

Анализ выделения генотипов с 1972 по 2015 г. продемонстрировал сохранение и циркуляцию некоторых из них в течение нескольких лет (рис. 3). Так, штаммы генотипа А3 выделены из морской воды на побережье Приморского края с 2009 по 2015 г. Штаммы V. parahaemolyticus генотипа B2 стали причиной заболевания в Новороссийске в 1973-1976 гг., штаммы генотипа С9 выделены из клинического материала больных в Бердянске в 1985-1988 гг., а клон D1 зарегистрирован во Владивостоке в 1997 и 2008 гг.

Также выявленные маркеры легли в основу созданной и зарегистрированной базы данных "Гены V. parahaemolyticus, содержащие INDEL-маркеры" [14].

Таким образом, на основании анализа указанных выше генов V. parahaemolyticus разработана система INDEL-типирования, включающая сконструированные праймеры к 6 INDEL-локусам. Использование предложенного варианта INDEL-типирования не требует внедрения особых лабораторных приемов и может быть самостоятельным методом с большой дискриминирующей способностью.

На основании исследования методом INDEL-типирования можно заключить, что штаммы парагемолитических вибрионов, выделенные из объектов окружающей среды и клинических проб на территории РФ с 1972 по 2015 г. могут быть типированы в зависимости от наличия генов основных факторов патогенности и принадлежности к пандемичному клону. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о циркуляции различных по генотипу штаммов парагемолитических вибрионов на территории Приморского края и в прибрежных районах Черного моря в течение длительного времени.

Литература

1. Fournier J.M., Quiliei M.L. Infections a vibrions non choleriques // Maladies Infectieuses. 2002. 8026-F-15. 7.

2. Беленева И.А., Масленникова Э.Ф., Магарламов Т.Ю. Физиологобиохимические свойства галофильных вибрионов Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus, изолированных из гидробионтов залива Петра Великого Японского моря // Биология моря. 2004. Т. 30, № 2. С. 114-119.

3. Ristori C.A., Iaria S.T., Gelli D.S., Rivera I.N. Pathogenic bacteria associated with oysters and estuarine water along the south coast of Brazil // Int. J. Environ. Health Res. 2007. Vol. 17, N 4. P. 259-269.

4. Смоликова Л.М., Воронежская Л.Г., Подосинникова Л.С., Голенищева Е.Н. Парагемолитические вибрионы - возбудители пищевых ток-сикоинфекций // Холера : сборник статей. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера". Ростов н/Д, 2003. С. 93.

5. Nitshibuchi M., Kaper J.B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium // Infect. Immun. 1995. Vol. 63. P. 2093-2099.

6. Park K.-S., Iida T., Yamaichi Y. et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus // Infect. Immun. 2000. Vol. 68, N 10. P. 5742-5748.

7. Park K.-S., Ono T., Rokuda M. et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahatmolyticus // Infect. Immun. 2004. Vol. 72, N 11. P. 6659-6665.

8. МУК 4.2.1793-03. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами : методические указания. М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2003.

9. Oka K., Asari M., Omura T., Yoshida M. et al. Genotyping of 38 ins-ertion/deletion polymorphisms for human identification using universal fluorescent PCR // Mol. Cell Probes. 2014. Vol. 28, N 1. P. 13-18.

10. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D. et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis // Emerg. Infect. Dis. 2007. Vol. 13, N 11. P. 1725-1732.

11. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишань-кин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № 5 (266). С. 41-44.

12. Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С., Ломов Ю.М. Мультилокусное VNTR-типирование культур холерных вибрионов, выделенных в г. Казань во время вспышки холеры летом 2001 года // Журн. микробиол. 2003. № 6. С. 11-15.

13. Nair G. B., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K. et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serova-riants // din. Microbiol. Rev. 2007. Vol. 20, N 1. P. 39-48.

14. Свидетельство о государственной регистрации базы данных. Гены Vibrio parahaemolyticus, содержащие INDEL-маркеры / Водопьянов С.О., Чемисова О.С., Водопьянов А.С., Олейников И.П.; правообладатель ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. № 2016620699 от 26.05.2016.

References

1. Fournier J.M., Quiliei M.L. Infections a vibrions non choleriques. In: Maladies infectieuses. 2002; 8026-F-15: 7.

2. Beleneva I.A., Maslennikova E.F., Magarlamov T.Yu. Physiological and biochemical characteristics of halophilic bacteria Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus isolated from marine invertebrates of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Biologiya moray [Marine Biology]. 2004; 30 (2): 114-9. (in Russian)

3. Ristori C.A., Iaria S.T., Gelli D.S., Rivera I.N. Pathogenic bacteria associated with oysters and estuarine water along the south coast of Brazil. Int J Environ Health Res. 2007; 17 (4): 259-69.

4. Smolikova L.M., Voronezhskaya L.G., Podosinnikova L.S., Golenishcheva E.N. Paragemolytic vibrios are the causative agents of food toxic infections. In: Cholera: collection of articles. Materials of the VIII Russian scientific-practical conference on the problem of "Cholera". Rostov-on-Don; 2003: 93. (in Russian)

5. Nitshibuchi M., Kaper J.B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium. Infect Immun. 1995; 63: 2093-9.

6. Park K.-S., Iida T., Yamaichi Y., et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus Infect Immun. 2000; 68 (10): 5742-8.

7. Park K.-S., Ono T., Rokuda M., et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahatmolyticus. Infect Immun. 2004; 72 (11): 6659-65.

8. MG 4.2.1793-03. Laboratory diagnostics of diseases caused by paragemolytic and other pathogenic for human vibrios: Methodological guidelines. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2003. (in Russian)

9. Oka K., Asari M., Omura T., Yoshida M., et al. Genotyping of 38 in-sertion/deletion polymorphisms for human identification using universal fluorescent PCR. Mol Cell Probes. 2014; 28 (1): 13-8.

10. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D., et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg Infect Dis. 2007; 13 (11): 1725-32.

11. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleynikov I.P., Mishan'-kin B.N., et al. INDEL- и VNTR-typing Vibrio cholerae strains, isolated in 2013 from the environment objects in the Russian Federation. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya [Public Health and Life Environment]. 2015; 5 (266): 41-4. (in Russian)

12. Mishan'kin B.N., Vodop'yanov A.S., Lomov Yu.M. Multilocus VNTR-genotyping of the cultures of Vibrio cholerae isolated in Kazan the outbreak of cholera in summer of 2001. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunology]. 2003; 6: 11-5. (in Russian)

13. Nair G.B., Ramamurthy T., Bhattacharya S.K., et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants. Clin Microbiol Rev. 2007; 20 (1): 39-48.

14. Certificate of state registration of the database. Vibrio parahaemolyticus genes containing INDEL-markers / Vodop'yanov S.O., Chemi-sova O.S., Vodop'yanov A.S., Oleynikov I.P .; rights holder FKUZ Rostov-on-Don anti-plague institute Rospotrebnadzor. No. 2016620699 of 05/26/2016. (in Russian)

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)