Молекулярно-биологический мониторинг возбудителей гнойного бактериального менингита на современном этапе

• Матосова Светлана Владимировна
• Миронов Константин Олегович
• Платонов Александр Евгеньевич
• Шипулина Ольга Юрьевна
• Шипулин Герман Александрович
• Нагибина Маргарита Васильевна
• Венгеров Юрий Яковлевич

РезюмеВ статье представлены результаты эпидемиологического мониторинга за возбудителями гнойных бактериальных менингитов. Проведен анализ этиологической структуры гнойных бактериальных менингитов и эпидемиологических особенностей менингококковой и пневмококковой инфекции. Рассмотрена серо-групповая характеристика N. meningitidis, серотиповая структура S. pneumoniae и приведены результаты мультилокусного секвенирования-типирования штаммов N. meningitidis. Обоснована роль молекулярно-биологических методов типирования в эпидемиологическом мониторинге возбудителей гнойных бактериальных менингитов.

Ключевые слова:бактериальные менингиты, генерализованная менингококковая инфекция, N. meningitidis, S. pneu¬moniae, полимеразная цепная реакция, мультилокусное секвенирование-типирование

Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) - группа тя­желых инфекционных заболеваний центральной нерв­ной системы (ЦНС). На долю ГБМ приходится 33% всех инфекционных поражений ЦНС [1]. Актуальность проблемы ГБМ определяется высокими показателями за­болеваемости, длительными сроками госпитализации, ри­ском неврологических осложнений и стабильно высокими показателями летальности. Среди различных этиологиче­ских форм ГБМ высокую медицинскую и социально-эко­номическую значимость представляют генерализованные формы менингококковой инфекции (ГФМИ) в связи с тем, что, несмотря на относительно низкий уровень заболева­емости, суммарный экономический ущерб от всех заре­гистрированных случаев ГФМИ в течение года значитель­но превосходит таковой от многих других инфекционных заболеваний [2].

Наиболее часто ГБМ вызывают N. meningitidis, H. influen­zae, S. pneumoniae, которые ответственны за 85% этиоло­гически расшифрованных случаев заболевания [3]. Важ­ным инструментом эпидемиологического надзора за ГБМ является определение этиологического агента [4], что также имеет важное клиническое значение с точки зре­ния выбора тактики терапии. Перспективным методом для диагностики ГБМ в настоящее время является определе­ние специфических фрагментов ДНК возбудителей в био­логическом материале (БМ) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5, 6]. Использование методик, основанных на ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РРВ), позволяет одновременно определять специфические фрагменты ДНК нескольких возбудителей. В России зарегистрированы следующие наборы реаген­тов для постановки ПЦР: "АмплиСенс^® N. meningitidis/ H. influenzae/S. pneumoniae-FL" (РУ № ФСР 2011/12380 от 25.11.2011) для выявления N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, а также для определения других микро­организмов, способных вызвать ГБМ, в числе которых, на­пример, L. monocytogenes, S. aureus (РУ № РЗН 2015/3111 от 18.09.2015 и № ФСР 2012/13998 от 29.10.2012).

Поскольку далеко не все представители видов N. meningitidis и S. pneumoniae способны вызвать ГБМ, важным на­правлением при проведении эпидемиологического надзора является молекулярно-биологический мониторинг, вклю­чающий идентификацию возбудителей генерализованных форм инфекции, в том числе обладающих резистентностью к антибактериальным препаратам, и выявление их принад­лежности к отдельным клонам или клональным комплексам. С этой целью используют ряд методических подходов, позво­ляющих определить антигенную и генетическую характери­стики бактерий. Молекулярно-биологические методы могут быть использованы при проведении как проспективного, так и ретроспективного эпидемиологического анализа ГБМ [7-10].

Характеристика антигенных свойств капсульных по­лисахаридов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae является ключевым элементом внутривидовой классифи­кации этих бактерий и основным объектом детекции при проведении микробиологического мониторинга циркулиру­ющих возбудителей, проводимых в рамках эпидемиологи­ческого надзора за ГБМ. Известно, что среди бактерий вида H. influenzae возбудителем ГБМ является только 1 серо-тип - H. influenzae типа b, выявление которого позволяет подтвердить этиологию заболевания. В то же время при проведении микробиологического мониторинга штаммов N. meningitidis и S. pneumoniae как этиологических агентов ГБМ возникает необходимость в определении нескольких серологических вариантов капсульного полисахарида.

Распространенным способом проведения генетической характеристики возбудителей ГБМ является метод мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ), основанный на секвенировании нуклеотидных последовательностей не­скольких генов "домашнего хозяйства" (Гены "домашнего хозяйства" (англ. housekeeping genes) - это гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций микро-/макроорганизма.). Метод МЛСТ де­монстрирует высокую дискриминирующую способность по сравнению с традиционными микробиологическими, серо­логическими методами и позволяет объединять результаты в общедоступную базу данных PubMLST через Интернет, что дает возможность сопоставлять данные, полученные ис­следователями на разных территориях и проводить оценку их эпидемической опасности. Применение метода МЛСТ N. meningitidis успешно зарекомендовало себя при характе­ристике основных возбудителей ГБМ на территории России [11-14].

Цель работы - определение этиологической структуры ГБМ, анализ результатов молекулярно-биологического мо­ниторинга штаммов N. meningitidis и S. pneumoniae с харак­теристикой клональных комплексов N. meningitidis, в том числе штаммов клонального комплекса ST-11 compLex/ET-37, с помощью массового параллельного секвенирования.

Материал и методы

В рамках проведенной работы были исследованы об­разцы биологического материала (кровь и спинномозговая жидкость) от 468 пациентов с ГБМ. Все пациенты, включенные в исследование, проходили стационарное лечение в ГБУЗ "Инфекционная клиническая больница № 2" Департа­мента здравоохранения г. Москвы с июня 2011 г. по январь 2017 г.

Для экстракции ДНК из образцов биологического ма­териала использовали набор реагентов РИБО-преп (про­изводство ФБУН "Центральный научно-исследователь­ский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора). Для определения ДНК возбудителей ГБМ применяли набор реагентов "АмплиСенс^® N. meningitidis/H. influenzae/ S. pneumoniae-FL" РУ № ФСР 2011/12380 от 25.11.2011 (производство ФБУН "Центральный научно-исследова­тельский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора). Для определения серогрупповой принадлежности менин­гококков, обнаруженных в образцах от 272 пациентов, использовали разработанную в ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора методику на основе ПЦР-РРВ для опреде­ления серогрупп А, В, С и W N. meningitidis [15]. Серотип S. pneumoniae, обнаруженных в биологическом материале от 46 пациентов, определяли с помощью метода на основе ПЦР-РРВ, позволяющего дифференцировать 16 серотипов S. pneumoniae, входящих в состав 10- и тринадцати­валентных вакцин, разработанного в ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора [16]. Данный метод регулярно применяют в ГБУЗ "Инфекционная клиническая больница № 2" Депар­тамента здравоохранения г. Москвы при проведении молекулярно-биологического мониторинга возбудителей ГБМ [17-21]. Амплификацию проводили на приборах RotorGene 3000/6000 (Corbettr Research, Австралия). МЛСТ осущест­вляли согласно международным требованиям по методике К.О. Миронова и соавт. [14]. Секвенирование проводили с помощью реагентов и оборудования фирмы "Applied Biosystems" (США). Массовое параллельное секвенирование проводили на платформе MiSeq c использованием на­бора MiSeqReagentKitv2, 500-cycles ("Illumina", США).

Результаты и обсуждение

По данным исследований, проведенных в ФБУН "Цен­тральный НИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора в разные годы, большинство случаев ГБМ с установленным этиоло­гическим агентом приходится на долю N. meningitidis, ко­торый с одинаковой частотой вызывает ГФМИ у взрослых и детей [22-25]. На втором месте в качестве этиологического агента ГБМ у взрослых пациентов находится S. pneumoniae, в то время как у детей - H. influenzae типа b; при этом зна­чительная доля случаев ГБМ остается нерасшифрованной. Этиологическая структура ГБМ у пациентов, госпитализиро­ванных на протяжении 2011-2016 гг. в ГБУЗ "Инфекционная клиническая больница № 2" Департамента здравоохранения г. Москвы, представлена в таблице.

Разработанная методика позволила определить серогруппу N. meningitidis в 98% случаев ГФМИ [15, 26]. По дан­ным проведенных исследований [20, 26], на территории Москвы в течение последних 5 лет наблюдается устойчивая тенденция к снижению удельного веса N. meningitidis серогруппы А, в 2014-2015 гг. - повышение доли N. meningitidis B и W серогрупп. При этом колебание доли N. meningitidis серогруппы C не позволяет говорить о каких-либо выраженных закономерностях (см. рисунок).

Полученные данные свидетельствуют о том, что на терри­тории Москвы происходит смена доминирующей серогруппы N. meningitidis. В то же время эпидемиологическую насто­роженность вызывает увеличение доли N. meningitidis серо-группы W (до 30%), учитывая, что менингококк данной серогруппы неоднократно выделяли в течение эпидемических подъемов заболеваемости во многих странах мира [27-29]. В связи с этим возникает необходимость проведения до­полнительных исследований, направленных на определение генетических характеристик менингококка и идентифика­цию гипервирулентных клональных комплексов N. meningitidis, ассоциированных с осложнением эпидемической об­становки.

В рамках молекулярно-биологического мониторинга штаммов S. pneumoniae, циркулировавших на террито­рии Москвы с 2011 по 2014 г., исследованы 46 образ­цов ДНК возбудителя, полученных от пациентов с ГБМ [21]. В 31 (67%) образце ликвора был определен серотип пневмококка. Выявлено следующее распределение серотипов: 6 образцов ликвора содержали специфиче­ские фрагменты ДНК пневмококка серотипа 23F, 4 - серотипа 14, по 3 образца содержали ДНК серотипов 6BA и 18, по 2 образца - серотипов 4, 7FA, 11AD, 19F, 15AF, по одному -серотипов 1, 3, 5, 18 и 19A. Специфические фрагменты ДНК пневмококка серотипов 2, 9VA и 9NL не обнаружены.

Большое значение исследователи придают изучению характеристик штаммов N. meningitidis серогруппы A, по­скольку подъемы заболеваемости ГФМИ в России в преды­дущие годы были связаны с циркуляцией менингококка этой серогруппы. В связи с этим было проведено иссле­дование генетических свойств 20 образцов, содержащих ДНК N. meningitidis серогруппы А методом МЛСТ. В связи с увеличением доли менингококка серогруппы W в этио­логической структуре ГФМИ были исследованы 18 образцов, содержащих ДНК N. meningitidis этой серогруппы. Все образцы были получены от пациентов с ГФМИ, прохо­дивших стационарное лечение с июня 2011 г. по декабрь 2015 г. [26]. Большинство штаммов менингококка серогруппы A имели сиквенс-тип ST-75 (19 образцов из 20), при этом все они принадлежали к клональному комплексу ST-1 complex/subgroup I/II, генетической субгруппе Х. Циркуля­ция менингококка серогруппы А, входящего в данный клональный комплекс, характерна для межэпидемического пе­риода и не ассоциирована с осложнениями эпидемической обстановки.

При проведении МЛСТ штаммов менингококка серогруппы W в 8 образцах из 10 была обнаружена ДНК, отно­сящаяся к клональному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex и в подавляющем большинстве имеющая сиквенс-тип ST-11 (15 образцов). Однократно были определены 2 новых сиквенс-типа, не встречавшихся ранее: ST-11585 и ST-11589. Клональный комплекс ST-11 complex/ET-37 complex является вторым по величине клональным ком­плексом, характерным для зарубежных штаммов, а входящие в этот клональный комплекс N. meningitidis неоднократно выделяли в периоды эпидемического неблагополучия в раз­ных странах. Выявление представителей данного гиперви­рулентного клонального комплекса диктует необходимость более широкой генетической характеристики этих штаммов.

Для поиска маркеров, ассоциированных с повышенными вирулентными свойствами отдельных представителей клонального комплекса ST-11/ET-37, был использован метод массового параллельного секвенирования [30]. Использова­ние данного метода позволяет увеличить объем получаемых данных и дискриминирующую способность генотипирования. Данный подход обладает большими возможностями для идентификации наиболее эпидемически опасных клонов, которые предположительно могут обладать селективными преимуществами и эволюционировать внутри клональных комплексов, обозначаемых с помощью метода МЛСТ. Прове­дено генотипирование с помощью массового параллельного секвенирования 4 образцов ДНК N. meningitidis серогруппы W, полученных от пациентов с ГФМИ. Результаты исследова­ния позволяют считать, что на территории Москвы в 2016 г. циркулировали как минимум 2 клона N. meningitidis серогруппы W, входящие в клональный комплекс ST-11 complex/ ET-37 complex.

Заключение

Дальнейшие исследования должны быть направлены на повышение уровня этиологической расшифровки ГБМ путем расширения спектра определенных возбудителей ГБМ с раз­работкой новых диагностических наборов реагентов на ос­нове ПЦР-РРВ. В рамках оперативного эпидемиологического надзора важно продолжать наблюдение за изменениями в серогрупповой структуре N. meningitidis и соотношением серо­типов S. pneumoniae. Необходим дальнейший молекулярно-биологический мониторинг за гипервирулентными клонами менингококков серогруппы W с помощью метода МЛСТ и массового параллельного секвенирования для оценки эпи­демической обстановки на наблюдаемой территории.

ЛИТЕРАТУРА

1. Филатова Т.Г. Бактериальные гнойные менингиты : учебное по­собие для студентов 6-го курса (специальности 060101 "Лечебное дело", 060103 "Педиатрия"). Петрозаводск : Изд-во ПетрГУ, 2014. 42 с.

2. Шаханина И.Л. Экономическая значимость менингококковой ин­фекции в современной России // Эпидемиология и инфекционные бо­лезни. 2009. № 4. C. 4-5.

3. Королева М.А., Белошицкий Г.В., Закроева И.М., Королева И.С. Этиологическая структура гнойных бактериальных менингитов в Рос­сийской Федерации в 2013 году // Материалы VII Ежегодного Всерос­сийского Конгресса по инфекционным болезням с международным уча­стием. М., 2015. С. 169-170.

4. Королева И.С., Белошицкий Г.В. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты: руководство по лабораторной диагностике / под ред. В.И. Покровского. М., 2007. 112 с.

5. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Королева И.С., Шипулина О.Ю. Пер­спективы диагностики бактериальных менингитов // Журн. микробиол. 1999. № 2. С. 71-76.

6. Тютюнник Е.Н. Использование полимеразной цепной реакции для диагностики и прогнозирования течения менингитов : дис. ... канд. мед. наук. М., 2001. 143 с.

7. Миронов К.О., Животова В.А., Матосова С.В., Шипулина О.Ю. и др. Генотипирование Neisseria meningitidis, вызвавших генерализованные формы менингококковой инфекции на территории Москвы в 2016 году // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика 2017". М., 2017. Т. 1. С. 223-225.

8. Миронов К.О., Королева М.А., Платонов А.Е., Королева И.С. и др. Генетическое типирование Neisseria meningitidis, циркулирующих в ре­гионах России // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2013. № 2. С. 36-40.

9. Королева И.С., Покровский В.И., Миронов К.О., Платонов А.Е. и др. Эпидемиологический мониторинг за гнойными бактериальными менингитами в историческом и современном аспектах // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2014. № 2. С. 52-56.

10. Achtman M., van der Ende A., Zhu P. et al. Molecular epidemiology of serogroup a meningitis in Moscow, 1969 to 1997 // Emerg. Infect. Dis. 2001. Vol. 7, N 3. P. 420-427.

11. Миронов К.О., Шипулин Г.А., Королева И.С., Платонов А.Е. Гено­типирование Neisseria mening'tidis // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. № 4. С. 18-21.

12. Миронов К.О., Платонов А.Е., Королева И.С., Тагаченкова Т.А. и др. Генетическая характеристика московских штаммов Neisseria meningitidis // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. 2011. Т. 13. № 2. С. 135-148.

13. Миронов К.О. Клональные комплексы Neisseria meningitidis, циркулирующие на территории России, и их роль в эпидемическом про­цессе менингококковой инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2016. № 6. С. 52-61.

14. Миронов К.О., Платонов А.Е., Королева И.С., Шипулин Г.А. Анализ московской популяции штаммов Neisseria meningitidis методом мультилокусного секвенирования-типирования // Журн. микробиол. 2006. № 2. С. 31-36.

15. Миронов К.О., Платонов А.Е., Дрибноходова О.П., Кусева В.И. и др. Методика для определения серогрупп A, B, C и W Neisseria meningitides методом ПЦР в режиме реального времени // Журн. микробиол. 2014. № 6. С. 35-42.

16. Миронов К.О., Платонов А.Е., Дунаева Е.А., Шипулин Г.А. Разра­ботка и клиническая апробация методики для определения серотипов Streptococcus pneumoniae методом ПЦР в режиме реального времени // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика 2014". М., 2014. С. 418-419.

17. Миронов К.О., Матосова С.В., Дрибноходова О.П., Шипулина О.Ю. и др. Определение серогрупп Neisseria meningitidis, вызвавших гене­рализованные формы менингококковой инфекции на территории Мо­сквы в 2012-2013 гг., с помощью ПЦР в режиме реального времени // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика 2014". М., 2014. С. 417-418.

18. Миронов К.О., Матосова С.В., Паркина Н.В., Шипулина О.Ю. и др. Определение серогрупп Neisseria meningitidis, выделенных из био­логического материала пациентов с генерализованными формами менингококковой инфекции методом полимеразной цепной реакции в ре­жиме реального времени // Материалы VII Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням с международным участием. М., 2015. С. 215-216.

19. Матосова С.В., Миронов К.О., Смирнова В.С., Шипулина О.Ю. и др. Определение серогрупп Neisseria meningitidis, выделенных из биологического материала пациентов с генерализованными фор­мами менингококковой инфекции на территории Москвы в 2015 го­ду, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Материалы VIII Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням с международным участием. М., 2016. С. 178.

20. Матосова С.В., Миронов К.О., Смирнова В.С., Шипулина О.Ю. и др. Характеристика серогруппового распределения Neisseria meningitidis, вызвавших генерализованные формы менингококковой инфекции на территории Москвы в 2016 году // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика 2017". М., 2017. С. 240-241.

21. Миронов К.О., Матосова С.В., Паркина Н.В., Шипулина О.Ю. и др. Определение серотипов Streptococcus pneumoniae, выделенных из образцов спинномозговой жидкости пациентов с гнойными ме­нингитами, методом полимеразной цепной реакции в режиме реаль­ного времени // Материалы VII Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням с международным участием. М., 2015. С. 224-225.

22. Матосова С.В., Ракчеева О.В., Шипулина О.Ю., Платонов А.Е. и др. Этиологическая диагностика менингитов и менингоэнцефалитов у детей методом ПЦР // Материалы VIII Всероссийской научно-практи­ческой конференции с международным участием "Молекулярная диа­гностика 2014". М., 2014. С. 422-423.

23. Матосова С.В., Паркина Н.В., Шипулина О.Ю., Платонов А.Е. и др. Расшифровка этиологии менингитов, менингоэнцефалитов и энце­фалитов методом ПЦР // Материалы VIII Всероссийской научно-прак­тической конференции с международным участием "Молекулярная диа­гностика 2014". М., 2014. С.424-425.

24. Матосова С.В., Паркина Н.В., Шипулина О.Ю., Чернышов Д.В. и др. Этиологическая диагностика гнойных менингитов и менингоэнцефалитов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Материалы VII Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням с международным участием. М., 2015. С. 216.

25. Матосова С.В., Смирнова В.С., Шипулина О.Ю. Молекулярно-биологические методы в этиологической диагностике гнойных менингитов и менингоэнцефалитов // Лаб. служба. 2017. T. 6, № 3. С. 98.

26. Матосова С.В., Миронов К.О., Платонов А.Е., Шипулина О.Ю. и др. Молекулярно-биологический мониторинг Neisseria meningitidis на территории Москвы в период с 2011 по 2015 г. // Эпидемиология и ин­фекционные болезни. Актуальные вопросы. 2016. № 2. С. 4-9.

27. AguiLera J.-F., Perrocheau A., Meffre C. et aL. Outbreak of Serogroup W135 MeningococcaL Disease after the Hajj PiLgrimage, Europe, 2000 // Emerg. Infect. Dis. 2002. VoL. 8, N 8. P. 761-767.

28. Mustapha M.M., Marsh J.W., Harrison L.H. GLobaL epidemioLogy of capsuLar group W meningococcaL disease (1970-2015): MuLtifocaL emer­gence and persistence of hyperviruLent sequence type (ST)-11 cLonaL com­pLex // Vaccine. 2016. VoL. 34, N 13. P. 1515-1523.

29. Mayer L.W., Reeves M.W., AL-Hamdan N. et aL. Outbreak of W135 meningococcaL disease in 2000: not emergence of a new W135 strain but cLonaL expansion within the eLectrophoretic type-37 compLex // J. Infect. Dis. 2002. VoL. 185, N 11. P. 1596-1605.

30. Миронов К.О., Животова В.А., Матосова С.В., Кулешов К.В. и др. Ха­рактеристика Neisseria meningitides серогруппы W, циркулирующих на тер­ритории Москвы, с помощью массового параллельного секвенирования // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017. № 4. (95). С. 33-37.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)