Набор учебных штаммов для освоения лабораторной диагностики чумы

• Сазанова Елена Владимировна
• Малюкова Татьяна Анатольевна
• Бойко Андрей Витальевич
• Вахрушина Наталья Ивановна
• Попов Юрий Алексеевич

Резюме

Государственная политика в области обеспечения биологической безопасности России предусматри­вает исключение или уменьшение использования в технологических процессах патогенных микроорганиз­мов. Актуально проведение научных исследований по снижению биологических рисков обучающих техно­логий путем замены вирулентных штаммов микроорганизмов на авирулентные.

Цель исследования - создание набора учебных штаммов патогенных для человека иерсиний и пастерелл для совершенствования методического обеспечения и снижения биологических рисков при подго­товке специалистов по лабораторной диагностике чумы.

Материал и методы. Исследования штаммов родов Yersinia и Pasteurella проводили с помощью бакте­риологического, иммунологических (ИФА, МФА), молекулярно-генетических (ПЦР, плазмидный скрининг), биологического методов.

Результаты. Сформирован набор, включающий штаммы Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, P. multocida (III-IV групп патогенности) и штаммы Y. pestis, авирулентные и со сниженной вирулентностью (I группы патогенности).

Заключение. Набор учебных штаммов предлагается для использования при подготовке специалистов в области лабораторной диагностики чумы. Применение учебных штаммов позволяет снизить вероятность лабораторного инфицирования обучающихся, освоить в полном объеме регламентированные методы диа­гностики чумы, приобрести навыки безопасной работы с патогенными биологическими агентами I группы.

Ключевые слова:Y. pestis, учебные штаммы, подготовка специалистов, биологическая безопасность, лабораторная диагностика чумы

Согласно концепции "Основы государственной по­литики в области обеспечения химической и био­логической безопасности РФ на период до 2025 года и дальнейшую перспективу" [1] необходимо исключить или минимизировать использование в технологических процес­сах патогенных микроорганизмов. Данный государственный подход необходимо учитывать при совершенствовании обу­чения персонала для работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) групп. В связи с этим актуальным явля­ется проведение научных исследований по снижению био­логических рисков обучающих технологий путем замены ви­рулентных штаммов микроорганизмов на учебные штаммы.

В настоящее время при проведении практических заня­тий на курсах профессиональной переподготовки и повыше­ния квалификации врачей, биологов и лаборантов, проводи­мых на базе отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФКУЗ "Российский научно-исследователь­ский противочумный институт "Микроб"" (ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб"), использование вакцинного штамма возбудителя чумы обеспечивает биологическую безопасность, но дает возможность изучить только часть биологических свойств, характерных для основного подвида биовара orientalis, и не позволяет освоить в полном объеме биологический метод лабораторной диагностики чумы. Применение вирулентных штаммов обеспечивает реализацию учебного плана, но по­вышает уровень биориска - вероятность инфицирования обучающихся в связи тем, что они зачастую обладают не­устойчивыми навыками выполнения микробиологических манипуляций в соответствии с правилами биологической безопасности. Снижения риска инфицирования можно до­биться путем использования в процессе обучения для само­стоятельной работы слушателей курсов штаммов Y. pestis со сниженной вирулентностью и авирулентных, т.е. LD₅₀ которых для белых мышей не превышает 1x10⁵ микробных клеток (м.к.) [2].

Проведенный информационный поиск показал отсут­ствие сведений о штаммах, регламентированных для ис­пользования в учебном процессе с целью обучения лабо­раторной диагностике чумы. Известны различные штаммы Y. pestis: предназначенные для изучения отдельных генети­ческих особенности возбудителя чумы [3-9], штаммы, рези­стентные к чумному бактериофагу Л-413 "С" [10, 11], а также тест-штамм Y. pestis, обладающий типичными свойствами культур, выделенных в Центрально-Кавказском высокогор­ном природном очаге чумы [12]. Вместе с тем использование этих штаммов в учебном процессе имеет ограниченное на­значение и не позволяет ознакомиться со всем комплексом типичных и атипичных биологических свойств возбудителя чумы, а также освоить комплекс методов лабораторной диа­гностики чумы [13].

Цель исследования - создание набора учебных штам­мов патогенных для человека иерсиний и пастерелл для совершенствования методического обеспечения учебного процесса и снижения биологических рисков при подготовке специалистов по лабораторной диагностике чумы.

Материал и методы

В работе использованы следующие штаммы: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Pasteurella multocida, отобранные из Государственной коллекции патогенных бак­терий (ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб") на основании паспорт­ных данных с учетом ранее разработанных критериев [14].

Штаммы Y. pestis выращивали на агаре и бульоне Хоттингера (рН 7,2) при температуре 28±1 °С в течение 48 ч. Штаммы Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica культивиро­вали на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 22±1 °С в течение 48 ч, в бульоне Хоттингера (рН 7,2) при 8±1 °С в течение 24 ч. Штамм P. multocida выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) с добавлением 1% гемолизированной крови при температуре 37±1 °С в течение 24 ч.

Культурально-морфологические, биохимические свой­ства, чувствительность к бактериофагам изучали с помощью стандартных методов, регламентированных при лаборатор­ной диагностике чумы [2].

Обнаружение видоспецифического антигена фракции 1 (F1) проводили с помощью методов флуоресцирующих анти­тел (МФА), иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали сертифицированные диагностические препараты "Им­муноглобулины диагностические флуоресцирующие чумные адсорбированные лошадиные сухие (ИДЧЛ)", "Тест-системы иммуноферментные для детекции чумного микроба моноклональные (ИФАПестФ1-М)". Постановку реакции и учет результатов вели в соответствии с инструкцией.

Характеристику состава основных генов вирулентности осуществляли молекулярно-генетическими методами. ПЦР-анализ проводили с праймерами на плазмидные и хромо­сомные детерминанты фрагментов генов (pla, irp2, IcrV, cafl, хромосомных локусов 3а и hmsH) с помощью набора реагентов для идентификации штаммов Y. pestis с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени "Ген Yersinia pestis идентификация -РГФ". Скрининг плазмидной ДНК осуществляли по методике С. Kado и S.Liu [15].

Вирулентность штаммов оценивали на морских свин­ках и беспородных белых мышах. Заражали белых мышей подкожно в область внутренней поверхности бедра взве­сью микроорганизмов в объеме 0,2 мл. Испытывали 9 доз с десятикратными разведениями 1х10⁹, 1х10⁸, 1х10⁷, 1х10⁶, 1х10⁵, 1х10⁴, 1х10³, 1х10², 20 м.к./мл. На каждую дозу брали по 6 белых мышей. Вирулентность 4 штаммов, отобранных в качестве перспективных для применения в учебном про­цессе при обучении биологическому методу лабораторной диагностике чумы, изучали на морских свинках. Заражали морских свинок подкожно в область внутренней поверх­ности бедра взвесью в объеме 0,5 мл с концентрациями 1х10⁹, 1х10⁸, 1х10⁷, 1х10⁶, 1х10⁵, 1х10⁴ м.к./мл. На каж­дую дозу брали по 2 животных. За животными наблю­дали в течение 14 дней от момента заражения. Всех пав­ших лабораторных животных вскрывали (191 белая мышь и 6 морских свинок), регистрировали патоморфологическую картину, от каждого лабораторного животного проводили посев паренхиматозных органов (лимфатических узлов, лег­ких, печени, селезенки) на агар Хоттингера рН 7,2 с целью подтверждения тождества с бактериальной культурой, ис­пользованной для заражения. LD₅₀ рассчитывали по методу Кербера [16].

Результаты и обсуждение

При создании набора штаммов для освоения лаборатор­ной диагностики чумы учитывали ранее предложенные кри­терии отбора, основным из которых является отсутствие или снижение вирулентности штаммов, используемых в учебных целях [14].

В процессе подготовки специалистов для работы с ПБА групп на практических занятиях отрабатываются следу­ющие навыки: 1) изучение видовых, морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств возбуди­теля чумы; биологических особенностей основного подвида, биоваров, штаммов; алгоритма дифференциации основного подвида от неосновных; 2) освоение бактериологического, иммунологических и молекулярно-генетических методов ла­бораторной диагностики чумы, применяемых для индикации и идентификации; 3) освоение биологического метода ла­бораторной диагностики чумы; 4) дифференциации Y. pestis от других патогенных для человека иерсиний, а также пастерелл, вызывающих массовые эпизоотии среди грызунов и спорадические заболевания людей.

С учетом поставленных задач в учебный набор необхо­димо включить штаммы со следующими характеристиками.

I. Y. pestis, LD₅₀ для которых - более 10⁵ м.к.; обладаю­щие типичными видовыми культурально-морфологическими свойствами, но отличающиеся:

■ по способности ферментировать рамнозу, арабинозу, глицерин;

■ по нитрифицирующей и денитрифицирующей ак­тивности для изучения алгоритма дифференциации Y. pestis основного подвида от неосновных подвидов;

■ по способности к пигментсорбции;

■ по зависимости роста колоний при 37 °С на питатель­ной среде в условиях дефицита ионов кальция;

■ по фибринолитической и плазмокоагулазной актив­ности;

■ по чувствительности к чумным бактериофагам Л413С, Покровской и псевдотуберкулезному бактериофагу Покровской.

Для демонстрации вариантов индикации с помощью регламентированных иммунологических методов МФА, ИФА учебные штаммы должны иметь следующие сочетания 2 плазмид: рFrа⁺pPst⁺, рFrа^-pPst⁺, рFrа⁺pPst, рFrа^-pPst.

Учебные штаммы должны иметь различные сочетания генов, детерминирующих вирулентность: pla, 3a, caf1, lcrV, hmsH и irp2, что необходимо для освоения молекулярно-генетических методов при индикации возбудителя чумы.

При заражении лабораторных животных учебные штам­мы должны формировать типичные патоморфологические изменения во внутренних органах, накапливаться и обеспе­чивать стабильное выделение бактериальной культуры при посеве проб внутренних органов животных на питательные среды.

II. Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis, патогенные для человека (возбудители иерсиниоза и псевдотуберку­леза), обладающие типичными видовыми биологическими свойствами и позволяющие провести дифференциацию с Y. pestis, а также имеющие биологические особенности, ак­туальные при проведении дифференциации с возбудителем чумы.

III. P. multocida - возбудитель пастереллеза, имеющий повсеместное распространение, в том числе на территории природных очагов чумы, вызывающий разлитые эпизоотии среди грызунов и массовый падеж, обладающие типичными видовыми биологическими свойствами, актуальными при дифференциации с Y. pestis.

Исследования проводили поэтапно.

Первый этап - отбор штаммов для дальнейшего изу­чения. На основании анализа паспортов в соответствии с разработанными критериями к потенциально учебным штаммам были отобраны 19 штаммов Y. pestis, 3 штамма Y. pseudotuberculosis, 1 штамм Y. enterocolitica, 1 штамм P. multocida.

Второй этап - изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств 19 штаммов Y. pestis. Все штаммы обладали типичными видовыми признаками. Анализ фенотипических свойств позволил от­нести 6 штаммов Y. pestis к неосновному подвиду caucasica spp. и 13 штаммов - к основному подвиду [17-19]. Штаммы основного подвида разделили на биовары с учетом ряда признаков: ферментации рамнозы, мелибиозы, арабинозы, глицерина; денитрифицирующей способности, продукции пестицина и чувствительности к пестицину I, плазмокоагулирующей способности, фибринолитической активности. В результате 1 штамм был отнесен к биовару orientalis, 4 -к биовару medievalis и 9 - к биовару antique.

Чувствительность к пестицину проявили 11 штаммов Y. рestis; пестициногенную, фибринолитическую и коагулазную активность - 9; зависимость роста колоний от ионов кальция при температуре 37 °С - 15, способность к пигмент-сорбции - 8. Полученные данные полностью совпали с молекулярно-генетическими характеристиками штаммов.

Чувствительность к чумным бактериофагам: Л413-С (цельному) и Покровской (цельному, в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000) была характерна для 19 штаммов Y. рestis. Кроме того, они проявили чувствительность и к псевдоту­беркулезному бактериофагу Покровской (цельный, в раз­ведениях 1:10, 1:100, 1:1000). Один штамм был резистентен к чумному бактериофагу Л-413.

Все 19 штаммы Y. pestis, имеющие плазмиду pFra, проду­цировали антиген FI.

Третий этап - оценка наличия детерминант патогенности (in vitro) была проведена у 19 испытуемых штаммов Y. pestis. По результатам ПЦР отобраны 9 штаммов, перспективных для использования в учебных целях, на основании отсутствия в геноме одной или более основных детерминант патогенности [20, 21]. В выборку вошли геноварианты: рFrа+ pPst+ рСаd+ Рgm^- (4 штамма); рFrа+ pPst+ рСаd^- Рgm+ (2 штамм); рFrа⁺ pPst+ рСаd^- Рgm^- (1 штамм); рFrа+pPst^-рСаd^-Рgm^- (1 штамм); рFrа^-pPst^-рСаd^-Рgm^- (1 штамм).

Проведенный плазмидный скрининг подтвердил наличие автономных плазмид, детектированных в ПЦР. Исключение составил штамм Y. pestis А-819, в клетках которого не обна­ружено автономной плазмиды pPst.

В следующий этап для определения степени вирулентно­сти вошли 17 штаммов. Два штамма, резистентных к бактерио­фагу Л-413 "С", планируется использовать для демонстрации данного свойства при проведении практических занятий.

Четвертый этап - оценка вирулентности 17 штаммов in vivo в результате заражения лабораторных животных штаммами Y. pestis по показателю LD₅₀ У вскрытых лабора­торных животных отмечали типичную патоморфологическую картину чумы [2]. При посеве на агар Хоттингера (рН 7,2) измененных участков внутренних органов (лимфатических узлов, паренхиматозных органов) отмечали рост колоний Y. pestis, а также стабильность выделения возбудителя из па­ренхиматозных органов.

Интерпретацию оценки вирулентности (in vivo) штаммов Y. pestis осуществляли с учетом следующих критериев:

■ высоковирулентные штаммы - LD₅₀ для белых мышей при подкожном заражении 5-10 м.к.;

■ слабовирулентные - LD₅₀ более 1·10⁵ м.к.;

■ авирулентные - LD₅₀ более 1·10⁶ м.к. [6].

В результате 6 штаммов были охарактеризованы как виру­лентные, 1 - слабовирулентный, 12 - авирулентные. Таким образом, по критерию "степень вирулентности" и результа­там проведенной ранее оценки биологических свойств, важ­ных для лабораторной диагностики чумы, были отобраны 10 штаммов Y. pestis, характеризующихся сниженной виру­лентностью. Из них у одного штамма LD₅₀ >10⁵ м.к., у 9 штам­мов LD₅₀ >10⁹ м.к.

Пятый этап - анализ биологических свойств штаммов Y. pseudotuberculosis (3 штамма), Y. enterocolitica (1 штамм), P. multocida (1 штамм), базовых для их индикации, иден­тификации и дифференциации от Y.pestis. Все штаммы об­ладали типичными видовыми свойствами. Совокупность характеристик 3 штаммов Y. pseudotuberculosis позволяет продемонстрировать морфологические, культуральные и физиолого-биохимические особенности, которые необхо­димо учитывать при дифференциальной диагностике чумы.

Шестой этап - формирование набора штаммов для ис­пользования в учебных целях. На основании полученных результатов и исходных требований к штаммам бактерий, планируемых к применению при изучении методов лабо­раторной диагностики чумы, отобраны 10 штаммов Y. pestis (1 вакцинный, 8 авирулентных, 1 со сниженной вирулентно­стью), 3 штамма Y. pseudotuberculosis, 1 штамм Y. enterocolitica, 1 штамм P. multocida.

Седьмой этап - разработка порядка применения учеб­ного набора штаммов на практических занятиях при осво­ении модуля "Микробиология и лабораторная диагностика чумы" (см. таблицу).

Таким образом, сформированный набор учебных штам­мов бактерий родов Yersinia и Pasteurella позволяет реализо­вать в полном объеме план учебного модуля "Микробиология и лабораторная диагностика чумы". Применение штаммов Y. pestis, авирулентных и со сниженной вирулентностью, дает возможность обучающимся на практических занятиях осво­ить регламентированные методы лабораторной диагностики чумы, приобрести навыки обеспечения биологической без­опасности работ с ПБА I группы и минимизировать вероят­ность лабораторного инфицирования курсантов.

Штаммы бактерий родов Yersinia и Pasteurella, включен­ные в набор, депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связан­ных с написанием статьи.

ЛИТЕРАТУРА

1. Основы государственной политики в области обеспечения хи­мической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу (утв. Президентом РФ 01.11.2013 № Пр-2573). URL: http://docs.cntd.ru/document/499057916 (дата обращения: 11.03.2016).

2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней : практическое руководство. 2-е изд. / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М. : Шико, 2013. 560 с.

3. Штамм бактерий Yersinia pestis subsp. pestis КМ 1190 (И-3244), содержащий плазмиду pYX 16, для внутривидовой дифференциации чумного микроба. Патент РФ № 2118362, 1998.

4. Штамм бактерий Yersinia pestis - тест-объект в генетических и микробиологических исследованиях. Патент РФ № 2002802, 1993.

5. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый как тест-объект для уточнения структуры и функции плазмиды кальцийзависимости у возбудителя чумы. Патент РФ № 2034023, 1995.

6. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый для уточнения строения и функции плазмиды синтеза фракции I и токсигенности чум­ного микроба. Патент РФ № 2034024, 1995.

7. Штамм чумного микроба Yersinia pestis, используемый в каче­стве тест-объекта для определения строения и функции новой до­полнительной плазмиды возбудителя чумы. Патент РФ № 1825375, 1993.

8. Штамм бактерий Yersinia pestis - продуцент фракции I чумного микроба. Патент РФ № 2031938, 1995.

9. Штамм бактерий Yersinia pestis, предназначенный для опреде­ления строения и функции новой дополнительной плазмиды мол.м. 19 МД у возбудителя чумы из таласского очага. Патент РФ № 2038376, 1995.

10. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Каштанова Т. Н., Яшечкин Ю.А. Анализ геномного полиморфизма типовых и атипичных штаммов воз­будителя чумы с использованием полимеразной цепной реакции с уни­версальными праймерами // Молекул. генетика. 2004. № 1. С. 22-26.

11. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый в качестве тест-штамма, резистентного к чумному бактериофагу Л-413 "С". Патент РФ № 2203316, 2003.

12. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый в качестве тест-штамма центрально-кавказского высокогорного природного очага чумы. Патент РФ № 2317325, 2008.

13. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального, регионального и федераль­ного уровней : методические указания. МУК 4.2.2940-11. М., 2011.

14. Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., Попов Ю.А. Учебные штаммы Yersinia pestis: критерии подбора, принципы применения // Пробл. особо опасных инфекций. 2014. Вып. 3. С. 38-41.

15. Kado С., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isoLation of Large and smaLL pLasmids // J. BacterioL. 1981. VoL. 145, N 3. Р. 1365-1373.

16. Ашмарин И.П. Воробьев А.А. Статистические методы в микро­биологических исследованиях. Л. : Медгиз, 1962. 180 с.

17. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pesti's, обеспечивающие цир­куляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 // Молекул. генетика. 2002. № 3. С. 3-23.

18. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. (ред). Природные очаги чумы Кав­каза, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М. : Медицина, 2004. 192 с.

19. Никифоров К.А., Одиноков Г.Н., Новичкова Л.А., Ерошенко Г.А. Дифференциация штаммов Yersinia pestis Алтайско-Гиссарской группы неосновных подвидов методом ПЦР // Пробл. особо опасных инфекций. 2015. № 1. С. 71-74.

20. Burrows T.W., Bacon G.A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence // Br. J. Exp. Pathol. 1956. Vol. 37. P. 481-493.

21. Iteman I., Guiyoule A., De Almeida A.M.P., Guilvout I. et al. Relationship between loss of pigmentation and deletion of the chromosomal ironregulated irp2 gene in Yersinia pestis: evidence for separate but related events // Infect. Immun. 1993. Vol. 61. P. 2717-2722.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)