Перспективы совершенствования иммунофлюоресцентного метода для диагностики риккетсиозов и Q лихорадки

• Пантюхина Анна Николаевна
• Тарасевич Ирина Владимировна
• Шпынов Станислав Николаевич

РезюмеВ статье представлены авторские данные по разработке риккетсиального мультиплексного диагностикума на основе корпускулярных антигенов Rickettsia prowazekii и Coxiella burnetti, меченных полупроводниковыми коллоидными квантовыми точками разного цвета флюоресценции. Диагностикум предназначен для одновременного выявления антител к R. prowazekii и C. burnetti методом иммунофлюоресцентной реакции наноагглютинации. Применение полупроводниковых коллоидных квантовых точек в качестве метки антигенов позволило не только увеличить число одновременно анализируемых в реакции антител, но и объективно визуализировать учет результатов реакции, повысить чувствительность анализа. В дальнейших планах - разработка мультиплексных диагностикумов для выявления антител к другим возбудителям, представляющих опасность для человека.

Ключевые слова:иммунофлюоресцентный анализ, квантовые точки, Rickettsia prowazekii, Coxiella burnetii, мультиплексный диагностикум

Иммунофлюоресцентный анализ (ИФА), предложен­ный А. Кунсом в 1940-х гг., до настоящего времени широко распространен в различных областях совре­менной медицины, биологии, цитометрии и молекулярно-генетическом анализе [1-3].

В практических исследованиях термин "ИФА" часто используется в качестве синонима термина "флюоресци­рующие антитела", хотя включает 2 альтернативных в ме­тодологическом отношении способа исследования: метод флюоресцирующих антител и метод меченых антигенов [4].

На практике наибольшее распространение получил метод флюоресцирующих антител. Одна из его модифика­ций - реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) -является "золотым стандартом" в диагностике риккетсиозов, причем до сего времени она не потеряла своего зна­чения [5].

Метод флюоресцирующих антигенов пока не нашел ши­рокого распространения несмотря на такие преимущества, как сочетание строгой специфичности корпускулярных анти­генов с высокой чувствительностью флюоресцентного ана­лиза, отсутствием аутофлюоресценции и наведенной флюо­ресценции фона [4, 6].

В практике применение флюоресцирующих антигенов для выявления риккетсиозных антител было начато в 1973 г., когда исследователями П.С. Барбаном и В.Я. Мирским были разработаны стабильные флюоресцирующие диагностикумы из Rickettsia prowazekii, R. typhi, R. sibirica, Coxiella burnetii и Bartonella quintana [7, 8]. Они представляли собой вы­сокоспецифичные корпускулярные антигены, меченные органическим флюорохромом-изотиоцианатом флюоресцеина (ФИТЦ), и применялись в иммунофлюоресцентной реакции микроагглютинации для выявления ранних анти­тел при эпидемическом и крысином сыпном тифе, а также при клещевом риккетсиозе Северной Азии, коксиеллезе, бартонеллeзе [9].

Использование для метки антигенов нового поколения флюорохромов - флюоресцирующих полупроводниковых квантовых точек (КТ) открывает новые возможности в усо­вершенствовании иммунофлюоресцентного анализа, в том числе меченых антигенов [1, 10, 11].

Предполагается, что применение КТ позволит констру­ировать более стабильные флюоресцирующие антигены с высокой фотостабильностью, яркостью и, что очень важно, с отсутствием наведенной флюоресценции фона, а это, в свою очередь, повысит специфичность детекции до уровня единичных корпускул [2, 12].

Применение КТ для метки антигенов с эмиссий от зеле­ного (520 нм) до ближнего инфракрасного (800 нм) позво­лит визуализировать большее число анализируемых антител (мультиплексность) в простом серологическом тесте - иммунофлюоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА). Это позволит в одном препарате одновременно и объективно выявлять специфические антитела к возбудителям ряда опасных риккетсиозных заболеваний человека [13-15].

Цель настоящей работы - разработка мультиплексного диагностикума из антигенов R. prowazekii, C. burnetii и при­менение его в ИФРНА для выявления антител к возбудителям эпидемического сыпного тифа и коксиеллеза.

Материал и методы

Для приготовления мультиплексного диагностикума использовали коммерческие корпускулярные антигены R. prowazekii и C. burnetii (II фаза) производства филиала ФГУП НПО "Микроген" "Пермское НПО "Биомед"" Минздрава России и ФГБУ "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Га­малеи" Минздрава России, а также экспериментальные се­рии этих антигенов. В работу брали антигены с активностью в прямом методе флюоресцирующих антител (пМФА) не ниже 1:1024. Были выбраны указанные виды риккетсий, по­скольку эти возбудители вызывают особо опасные заболева­ния у людей: эпидемический сыпной тиф (ЭСТ) и коксиеллез (Q лихорадку, син. ку-лихорадка).

В работе использовали коммерческие типовые диа­гностические сухие сыворотки к R. prowazekii, C. burnetii, R. sibirica производства филиала ФГУП НПО "Микроген" Пермское НПО "Биомед" Минздрава России и ФГБУ "Феде­ральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России, а также сыворотки крови от пациентов, перенесших сыпной тиф (8 сывороток на 10-й день заболевания), Q лихорадку (7 сывороток на 7-й и 10-й дни заболевания).

Приготовление мультиплексного диагностикума про­водили по разработанному ранее способу [16, 17]. Способ включал метку корпускулярных антигенов R. prowazekii и C. burnetii полупроводниковыми коллоидными КТ разного цвета флюоресценции.

Антигены R. prowazekii были конъюгированы с КТ с дли­ной волны флюоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), а антиген C. burnetii с КТ с длиной волны флю­оресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм). Затем очищенные и стандартизованные R. prowazekii и C. burnetii соединяли в мультиплексный диагностикум и использовали его в ИФРНА для выявления антител к соот­ветствующим возбудителям.

В сравнительных серологических исследованиях исполь­зовали "золотой стандарт" серодиагностики - РНИФ, кото­рую ставили и учитывали по общепринятой методике [18].

ИФРНА с мультиплексным диагностикумом проводили по следующей методике. Предварительно готовили последо­вательные двукратные разведения исследуемых сывороток крови - с 1:20 до 1:2560. На предметное стекло с лунками наносили по 5 мкл каждого разведения сывороток крови, начиная с наибольшего. Постановку ИФРНА сопровождали контролем мультиплексного диагностикума на спонтанную агглютинацию. Параллельно ставили контроль с положи­тельными и отрицательной сыворотками крови, взятыми в разведении 1:20. В разведения испытуемых сывороток крови и в контроль добавляли по 5 мкл диагностикума и перемешивали ингредиенты. Взаимодействие мульти­плексного диагностикума с антителами происходило во влажной камере в термостате при температуре 37 ^оС в тече­ние 45 мин. После этого препарат высушивали на воздухе в термостате. Учет результатов и оценку реакции проводили под иммерсионной системой флюоресцентного микроскопа, просматривая не менее 10 полей зрения в каждом мазке.

Результаты

Первая серия экспериментов была посвящена изуче­нию иммунофлюоресцентной активности мультиплексных диагностикумов. Исследование выполнено с сыворот­ками крови экспериментально инфицированных животных R. prowazekii, R. sibirica, C. burnetii.

Оценку результатов проводили по 4-крестовой системе, используя шкалу оценки мультиплексных диагностикумов в ИФРНА, представленную в табл. 1.

За положительный результат принимали агглютинаты ве­личиной не менее чем на 3+ или 4+. Титр исследуемой сыво­ротки крови соответствовал ее максимальному разведению, в котором величина агглютината оценивалась не ниже чем на 3+. Чтение и учет следует начинать с контроля.

Исследование иммунных сывороток крови животных с мультиплексным диагностикумом в иммунофлюоресцентной реакции наноагглютинации

При просмотре препаратов в поле зрения микроскопа в контроле на спонтанную агглютинацию (рис. 1) и в кон­троле с отрицательной сывороткой (рис. 2) наблюдали изо­лированные ярко-красные корпускулы R. prowazekii и ярко-зеленые корпускулы C. burnetii, четко контрастируемые на черном фоне.

При исследовании с мультиплексным диагностикумом положительных сывороток крови к R. prowazekii (рис. 3) наблюдали различной величины агглютинаты из корпускул R. prowazekii, флюоресцирующие ярко-красным цветом, а корпускулы C. burnetii располагались отдельно друг от друга и флюоресцировали зеленым цветом.

При исследовании с мультиплексным диагностикумом положительных сывороток крови к C. burnetii (рис. 4) наблюдали специфические агглютинаты из корпускул C. burnetii, флюоресцирующие ярко-зеленым цветом и мече­ные R. prowazekii, расположенные в виде отдельных изоли­рованных корпускул красного цвета.

С сыворотками крови к R. sibirica (рис. 5) мультиплекс­ный диагностикум не взаимодействовал. В этих препаратах меченые R. prowazekii (красного цвета) и меченые C. burnetii (зеленого цвета) были расположены в виде отдельных изо­лированных корпускул.

Таким образом, приготовленный мультиплексный диагностикум позволяет четко различать по цвету флюоресценции и агглютинатам R. prowazekii и C. burnetii на черном фоне препаратов, что позволяет объективно и достоверно оцени­вать результаты ИФРНА.

Кроме того, он обладает достаточной иммунофлюоресцентной активностью, так как образует специфические агглютинаты только с гомологичными сыворотками крови и не взаимодействует с гетерологичными сыворотками крови, а также не дает спонтанной агглютинации в кон­троле.

Как показано на рис. 3 и 4, мультиплексный диагностикум позволяет визуализировать антитела к R. prowazekii в титре 1:640 или C. burnetii в титрах 1:160 в одном препа­рате, упрощая и сокращая методику выявления специфиче­ских антител в сыворотках крови пациентов.

В следующей серии экспериментов изучали специфич­ность ИФРНА с мультиплексным диагностикумом.

Исследования были проведены с сыворотками крови кроликов, инфицированных R. prowazekii, C. burnetii, R. conorii caspia, R. sibirica и Orientia tsutsugamushi (табл. 2).

Как следует из представленных в табл. 2 данных, муль­типлексный диагностикум не образует специфические агглютинаты с гетерологичными сыворотками крови (R. conorii caspia, R. sibirica и О. tsutsugamushi), в то время как в поло­жительных контрольных сыворотках крови к R. prowazekii и к C. burnetii наблюдали формирование агглютинатов вели­чиной не менее 3+ или 4+.

Положительные результаты по оценке иммунофлюоресцентной активности и специфичности мультиплексного диагностикума позволили перейти к испытаниям по выявлению специфических антител в сыворотках крови пациентов, пере­несших болезнь Брилла-Цинссера, Q лихорадку, астраханскую пятнистую лихорадку. В качестве отрицательного контроля ис­пользовали сыворотки крови условно здоровых людей.

Исследование сывороток крови проводили параллельно в РНИФ. Результаты исследований сведены в табл. 3.

Из данных, приведенных в табл. 3, следует, что при изу­чении сывороток крови с помощью мультиплексного диагностикума в ИФРНА были выявлены антитела только в сыво­ротках крови к R. prowazekii и к Coxiella burnetii. Сыворотки крови пациентов с астраханской пятнистой лихорадкой, со­держащие антитела к R. conorii caspia, выявляемые в РНИФ, с мультиплексным диагностикумом не реагировали. Отрица­тельные результаты были получены и при тестировании сы­вороток крови условно здоровых людей.

Обсуждение ИФРНА представляет собой простой двухкомпонентный тест, позволяющий реализовать реакцию взаимодействия "флюорес­цирующий антиген-специфическое антитело" на предметном сте­кле без дополнительных специальных методических приемов (от­мывания, встряхивания, многократного внесения ингредиентов).

К преимуществам ИФРНА следует отнести высокую специ­фичность, простоту постановки и минимум затраченного времени и ингредиентов.

Применение полупроводниковых коллоидных КТ для метки антигенов позволило не только увеличить число одновременно анализируемых в реакции антител до двух (R. prowazekii, C. burnetii), но и объективно визуализировать учет результатов реакции, повысить детекцию до уровня от­дельных корпускул R. prowazekii, C. burnetii, что позволило достоверно оценивать результаты реакции.

Представленные материалы по изучению чувствительно­сти ИФРНА в сравнении с другим серологическим тестом -РНИФ позволили сделать заключение о достаточной, сопо­ставимой с РНИФ чувствительности ИФРНА. Следует отме­тить, что повышению специфичности ИФРНА способствует и отсутствие наведенной флюоресценции фона препарата.

Высокую специфичность ИФРНА с мультиплексным диагностикумом подтверждают исследования, проведен­ные с сыворотками крови людей, переболевших болезнью Брилла-Цинссера или Q лихорадкой, а также с гетерологичными сыворотками крови.

Как показали результаты, в ИФРНА были обнару­жены антитела только к соответствующим возбудителям (R. prowazekii, C. burnetii) при отрицательных результатах исследования гетерологичных сывороток крови пациентов (R. sibirica, R. conorii caspia, O. tsutsugamushi).

Таким образом, данные изучения ИФРНА с мультиплекс­ным диагностикумом из R. prowazekii, C. burnetii с исполь­зованием разного серологического материала позволяют рассматривать эту реакцию как строго специфическую и об­ладающую достаточной чувствительностью.

ИФРНА в методическом отношении более доступна для практического здравоохранения, так как технологически проста в применении, демонстративна и может быть доку­ментирована (сохранена на предметном стекле).

При дальнейшем развитии ИФА для диагностических целей планируется разработка мультиплексных диагностикумов из антигенов других возбудителей, представляющих опасность для человека.

ЛИТЕРАТУРА

1. Воробьев И.А., Рафаловская-Орловская Е.П., Гладких А.А., Поташникова Д.М. и др. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в микроскопии и цитометрии // Цитология. 2011. Т. 53, № 5. C. 392-403.

2. Олейников В.А. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. 2011; 37(2): C. 171-189.

3. Coons A., Creech H., Jones R. ImmunoLogicaL properties of an an­tibody containing a fLuorescent group // Proc. Soc. Exp. BioL. Med. 1941. VoL. 47, N 2. 200-202.

4. Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н. Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск : УрО АН СССР, 1988. 176 с.

5. Bizzini A., OLivier P., Baud D., Edouard S. et aL. EvaLuation a new seroLogicaL test for the detection of anti-CoxieLLa and anti-Rickettsia anti­bodies // Microbes Infection. 2015. VoL. 17. P. 811-816.

6. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах М., 1972. 495 с.

7. Барбан П.С., Мирский В.Я. Иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации риккетсий. Сообщение I. Выявление антител против риккетсий Провачека и Музера // Лаб. дело. 1973. № 1. С. 28-30.

8. Барбан П.С., Мирский. В.Я. Иммунофлуоресцентная реакция ми­кроагглютинации риккетсий. Сообщение 2. Выявление антител Бернета при помощи иммунофлуоресцентной микроагглютинации // Лаб. дело. 1975. № 5. С. 315.

9. Мирский В.Я. Иммунофлуоресцентная реакция микроагглюти­нации как метод серологической диагностики риккетсиозов : дис. ... канд. мед. наук. Челябинск, 1981. 202 с.

10. Gouriet F., Levy P.Y., Drancourt M., RaouLt D. Comparison of the new InoDiag automated fLuorescence muLtipLexed antigen microarray to the reference technique in the serodiagnosis of atypicaL bacteriaL pneumonia // CLin. MicrobioL. Infect. Dis. 2008. VoL. 14. P. 1119­-1127.

11. Pathak S., Davidson M.C., SiLva G.A. Characterization of the functionaL binding properties of antibody conjugated quantum dots // Nano Lett. 2007. VoL. 7, N 7. 1839-1845.

12. Fengqin Hu, YuLiang Ran, Zhuan Zhou, Mingyuan Gao. Preparation of bioconjugates of CdTe nanocrystaLs for cancer marker detection // NanotechnoLogy. 2006. VoL. 17. P. 2972-2977.

13. dan W., MaxweLL D.J., Gao X., BaiLey R. et aL. Luminescent quantum dots for muLtipLexed bioLogicaL detection and imaging // Curr. Opin. BiotechnoL. 2002. VoL. 13. P. 40-46.

14. Faucher J.F., SocoLovschii C., Aubry C., Chirouze C. et aL. BriLL-Zinsser disease in Moroccan man, France, 2011 // Emerg. Infect. Dis. 2012. VoL. 18. P. 171-182.

15. PortiLLo A., Santibanez S., Garcia-ALvarez L., PaLomar A.M. et aL. Ricketsioses in Europe // Microbes Infection. 2015. VoL. 17, N 11-12. P. 834-838.

16. Патент RU 2381304 "Способ синтеза полупроводниковых кван­товых точек". Авторы: Новичков Р.В., Вакштейн М.С., Нодова Е.Л., Маняшин А.О., Тараскина И.И. Опубликовано 10.02.2010.

17. Патент на изобретение № 2557951 "Способ получения мульти­плексного риккетсиального диагностикума". Авторы: Пантюхина А.Н., Тарасевич И.В., Вакштейн М.С., Дежуров С.В. Зарегистрирован в Госрее­стре изобретений РФ 30 июня 2015 г.

18. Fournier P.E., Marrie T.J., Raouit D. Diagnosis of Q fever // J. CLin. MicrobioL. 1998. VoL. 36, N 7. P. 1823-1834.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)