В последние десятилетия во многих странах мира отмечается активизация природных очагов эндемических риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), и Российская Федерация не является исключением. В России данная группа в основном представлена сибирским клещевым тифом (СКТ) (син.: клещевой риккетсиоз или клещевой сыпной тиф Северной Азии), этиологическим агентом которого является Rickettsia sibirica subsp. sibirica. В 2013 г. заболеваемость СКТ составила 1,10 на 100 тыс. населения, в 2014 г. - 1,15 на 100 тыс. населения, в 2015 г. -1,78 на 100 тыс. населения [1]. Также из группы КПЛ регистрируются случаи заболевания астраханской пятнистой лихорадкой, вызванной R. conorii subsp. caspia и дальневосточным клещевым риккетсиозом с этиологическим агентом R. heilongiangensis, клиническая картина которого впервые была описана в Хабаровском крае [2]. Однако вклад этих нозологий в структуру заболеваемости риккетсиозами на территории России в сравнении с СКТ существенно меньше.
Алтайский край лидирует по числу заболеваний СКТ не только в Западной Сибири, но и по России в целом [3]. СКТ на территории края стали выявлять с 1945 г. и за последние 70 лет было зарегистрировано более 28 тыс. случаев заболевания. Показатели заболеваемости данным риккетсиозом на территории края колеблются в разные годы от 21,04 до 70,36 на 100 тыс. населения и превышают этот показатель по России более чем в 20 раз.
Наиболее высокий уровень заболеваемости отмечен на Алтае в 2001 г., когда было зарегистрировано 1867 случаев, составляющих 54% всех случаев на территории России. Заболевания СКТ регистрируются с апреля по октябрь-ноябрь с пиком в мае-июне (67,4% случаев). Второй, менее выраженный подъем заболеваемости приходится на сентябрь-октябрь.
До 2013 г. диагноз СКТ в Алтайском крае лабораторно подтверждали на основании серологических методов, в частности реакции связывания комплемента (РСК). При этом лабораторное подтверждение диагноза не превышало 25-30%. С 2013 г. спектр методов лабораторных исследований значительно расширился [4, 5].
Цель работы - дать клинико-лабораторную характеристику СКТ на современном этапе с верификацией этиологического агента комплексом лабораторных методов исследования.
Материал и методы
Сбор образцов
С апреля по октябрь 2013-2014 гг. на базе инфекционного отделения КГБУЗ ГБ № 5 г. Барнаула были обследованы 118 больных, поступивших на стационарное лечение с диагнозом СКТ. Материалом для исследования служили парные сыворотки крови и сгустки, полученные из венозной крови больного, а также биоптат с места первичного аффекта. Материал из локтевой вены забирали в утренние часы в 1-е сутки поступления в стационар (в среднем на 4,4±0,4-й день болезни) и в динамике через 7-10 дней. В среднем на 8±0,5-й день болезни у больных, имевших первичный аффект, взят биоптат (корочка). Лабораторные исследования проводили на базе ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора (ЦНИИЭ) и ФГБУ "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России (ФНИЦЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи).
Экстракция ДНК ДНК выделяли с помощью набора Рибо-преп (ЦНИИЭ) в соответствии с рекомендациями производителя. Выделенную ДНК элюировали в 50 мкл буфера и хранили при -70 °C до проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Риккетсии группы КПЛ выявляли методом ПЦР в режиме реального времени, предложенным Stenos и соавт. [6], с небольшими модификациями.
В качестве мишени использовали фрагмент гена цитратсинтазы длинной 74 п.о. (позиции 1126-1199 нт в референсном сиквенсе Rickettsia rickettsii, номер в GenBank - U59729).
ПЦР проводили в объеме 25 мкл с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени RotorGene 6000 ("Qiagen", Германия).
Реакционную смесь, содержащую 10 мкл исследуемой пробы, по 5 пмоль прямого и обратного праймеров, 3 пмоль зонда, 2,5 мкл 1,76 мМ дНТФ(Т) (ЦНИИЭ), 5 мкл смеси PCRmix2 FEP/FRT (ЦНИИЭ), 0,5 мкл полимеразы TaqF (ЦНИИЭ), доводили H2O (miLLiQ) до 25 мкл.
Термоциклирование проводили в следующем режиме: 95 °C - 15 мин, 95 °C -10 с, 60 °C - 40 с (n=45). Флюоресцентный сигнал регистрировали при 60 °C.
Типирование риккетсий
Типирование риккетсий осуществляли на основании фрагмента гена цитратсинтазы gltA (749 нт, позиции 76-824 нт в референсном сиквенсе R. sibirica subsp. sibirica штамм 246, номер доступа в GenBank - U59734) и фрагмента гена, кодирующего белок наружной мембраны - ompA (351 нт, позиции 60-410 нт в референсном сиквенсе R. sibirica subsp. sibirica штамм 246, номер доступа в GenBank - U43807). Для этого использовали 2 пары праймеров собственного дизайна: gLtA-s (5'-AGGATGTAATCGATAT AAGTAGGGTATC-3'), gLtA-as (5'-AAGCATATTTATTACCGCTTCATTA GCC-3') и ompA-s (5'-CTTTATTCACCACCTCAACCGCA-3'), ompA-as (5'-TAATAGTAACAGGCAACARGTTACCTC-3').
Фрагменты генов gltA и ompA были амплифицированы и секвенированы. Амплификацию осуществляли с использованием "горячего старта" в 25 мкл реакционной смеси, содержавшей 2 мкл ДНК, по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 пмоль/мкл), 2,5 мклд НТФ (1,76 мM, ЦНИИЭ), 10 мкл ПЦР-смеси bLue-2 (ЦНИИЭ). Термоциклирование осуществляли в следующем режиме: 95 °C - 2 мин; 95 °C - 15 с, 65 °C - 20 с, 72 °C - 30 с (n=40); 72 °C - 5 мин. Реакцию проводили на приборе Maxy Gene Gradient thermocycLer ("Axygen", США). Результаты анализировали в 1,2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Секвенирование осуществляли капиллярным методом с помощью прибора для автоматического секвенирования ABI-Prism 3500 XLdevice ("AppLied Biosystems", США)
Серологические исследования
Для выявления специфических антител в парных сыворотках крови применяли реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), являющуюся основным референсным методом при серологической диагностике риккетсиозов [7]. Для постановки РНИФ использовали корпускулярные гомологичный и гетерологичные антигены R. sibiricas subsp. sibirica штамм Нецветаев, R. prowazekii штамм Brein1, Coxiella burnetii штамм Grita в фазе II (производство ФНИЦЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи) и флюоресцирующий козий конъюгат к IgG, IgM и IgA человека (производство "MPBiomedicaLs", Франция). После скринингового исследования сывороток крови в разведениях 1:20, 1:40 на наличие суммарных иммуноглобулинов (Ig) положительные образцы последовательно разводили до титра 1:2560, а при необходимости и более. Результаты учитывали визуально на основе оценки интенсивности специфической флюоресценции, морфологических особенностей возбудителя и наличия краевого свечения, просматривая не менее 10 полей зрения во флюоресцентном микроскопе Nicon ("NICON", Япония). За титр исследуемой сыворотки принимали ее максимальное разведение, при котором наблюдается специфическая флюоресценция не ниже чем на 3 креста.
Статистическая обработка материала
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программного продукта Statistica 10.0 и возможностей Microsoft ExceL 2007. В работе использованы различные методы статистической обработки в зависимости от типа случайных величин и поставленной задачи исследования.
Значения количественных признаков представлены в виде средних арифметических (M) и стандартных ошибок (m). Значения количественных признаков представлены в виде частот, процентов и стандартных ошибок долей (5).
Для оценки типа распределения признаков использовали показатели эксцесса и асимметрии, характеризующие форму кривой распределения. Распределение считали нормальным при значении данных показателей от -1 до 1.
Для сравнения абсолютных значений альтернативных качественных признаков в независимых выборках использовали непараметрический критерий χ2. При наличии малых частот (<10) для данного критерия использовали поправку Йетса на непрерывность.
Поскольку распределение не соответствовало нормальному, использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни (для независимых выборок).
Критический уровень статистической значимости при проверке нулевой гипотезы принимали равным 0,05. Во всех случаях использовали двусторонние варианты критериев.
Результаты
ДНК R. sibirica subsp. sibirica выявлена у 30 (25,4%) из 118 пациентов, и у 1 (0,9%) из 118 больных была генотипирована ДНК R. heilonjiangensis. У 45 (38,1%) из 118 пациентов диагноз СКТ выставлен на основании клинико-эпидемиологических данных. У 42 (35,6%) из 118 больных были найдены маркеры других клещевых инфекций (иксодового клещевого боррелиоза, гранулоцитарного анаплазмоза, клещевого энцефалита).
Определение антител в РНИФ осуществляли только у 30 пациентов, у которых в образцах ДНК выявлена R. sibirica subsp. sibirica. Антитела к R. sibirica subsp. sibirica в сыворотке крови обнаружены у всех 30 пациентов в титрах от 1:40 до 1:2560.
Описание особенностей клинического течения СКТ проводили только у пациентов с молекулярно-биологическим подтверждением диагноза, сравнивая с течением болезни пациентов, у которых диагноз СКТ был выставлен на основании клинико-эпидемиологических данных (см. таблицу).
&hide_Cookie=yes)
Среди заболевших доминировали мужчины - 17/30 (56,7%), что, вероятнее всего, связано с более частым их контактом с природными очагами СКТ при охоте, рыбалке, сезонной работе в сельской местности. Женщины составили 43,3% (13/30).
Возрастной состав заболевших колебался от 18 до 78 лет (средний возраст - 52,8±3,1 года).
По социальному признаку среди заболевших преобладали пенсионеры - 12 (40,0%) из 30, рабочие и служащие государственных предприятий составили 9 (30,0%) из 30, остальные 30% пришлись на долю студентов -4 (13,3%) из 30 и неработающих граждан - 5 (16,7%) из 30.
Городские жители составили 23 (76,7%) из 30, жители сельской местности - 7 (23,3%) из 30.
У 5 (16,7%) из 30 заражение произошло в пределах города и пригорода (в парках, скверах, садах). Остальные 25 (83,3%) человек отмечали пребывание на территории различных районов Алтайского края.
Только у 21 (70,0%) из 30 больных в анамнезе имелось указание на присасывание клеща. 9 (30,0%) из 30 больных не упоминали о факте присасывания, хотя и не отрицали возможность такового. Это связано, вероятнее всего, с безболезненностью присасывания клеща, тем более что у всех больных при осмотре был найден первичный аффект. У 9 (30,0%) из 30 человек было ≥2 первичных аффектов.
Чаще всего первичный аффект располагался в области волосистой части головы, шеи и уха - 15 (50,0%) из 30, на нижних конечностях - у 6 (20,0%) человек, в области туловища - у 5 (16,7%) человек, на верхних конечностях -у 4 (13,3%). B 28 (93,3%) из 30 случаев первичный аффект представлял собой инфильтрат с некрозом в центре, окруженный зоной гиперемии от 2 до 20 мм в диаметре.
Достоверно инкубационный период установлен у 21 (70,0%) больных, длительностью от 2 до 12 дней, составляя в среднем 7,6±0,6 дня. Поскольку у 9 человек отсутствовало указание на присасывание клеща, определение инкубационного периода не представлялось возможным.
Острое начало с симптомов интоксикации и лихорадки отмечали 25 (83,3%) человек. У 5 (16,7%) имел место продромальный период продолжительностью от 1 до 3 дней, который характеризовался субфебрилитетом, головной болью и общей слабостью.
Лихорадка в среднем продолжалась 6,4±0,3 дня. Слабость присутствовала у всех больных (100%), головная боль -у 96,7%, озноб - у 93,3%, потливость отмечали 63,3% заболевших, расстройство сна - 63,3%, артралгии - 63,3%, миалгии - 60,0% и тошноту - (33,3%) заболевших. Макуло-папулезная сыпь располагалась на туловище, конечностях, исключая ладони, стопы и лицо. Регионарный лимфаденит встречался в 53,3% случаев.
В периферической крови, взятой при поступлении в стационар в среднем на 4,4±0,4-й день от начала заболевания, отмечалась относительная лимфопения (<20,0%) -у 24 (80,0%) человек, повышение СОЭ >15 мм/ч - у 22 (73,3%), сегментоядерный нейтрофилез >70% - у 7 (23,3%), лейкопения <4х109/л - у 2 (6,67%), лейкоцитоз >9х109/л -у 2 (6,67%).
Изменения в биохимическом анализе крови (кровь забрана на 4,4±0,4-й день от начала болезни) характеризовались повышением активности трансаминаз печени (АЛТ и АСТ) у 17 (73,9%) из 23 - от 44 до 162 МЕ/л для АЛТ (норма -до 40 МЕ/л) и от 36 до 120 МЕ/л для АСТ (норма -до 31 МЕ/л), гипербилирубинемией за счет непрямого билирубина от 21 до 44 мкмоль/л (норма общего билирубина -8,5-20,5 мкмоль/л) - у 3 (13,0%) из 23 больных.
Протеинурия (>0,033-0,099г/л) наблюдалась у 23 (76,7%) из 30 больных, лейкоцитурия (>3 в поле зрения для мужчин и 6 в поле зрения для женщин) - у 16 (53,3%) из 30.
При сравнительном анализе клинического течения случаев СКТ с положительным результатом молекулярно-биологических исследований и случаев, при которых диагноз был выставлен только на основании клинико-эпидемиологических данных, в длительности симптомов достоверных различий не выявлено. Достоверно чаще головная боль встречалась у пациентов без молекулярно-биологического подтверждения диагноза, в частоте встречаемости остальных симптомов достоверных отличий не выявлено. Первичный аффект, общая слабость и макулопапулезная сыпь наблюдались у всех пациентов обеих групп.
СКТ и дальневосточный клещевой риккетсиоз характеризуются схожими клиническими проявлениями и перекрестными серологическими реакциями, что затрудняет их дифференциальную диагностику. Таким образом, для верификации диагноза необходимо проводить молекулярное типирование этиологического агента.
Заключение СКТ характеризовался циклическим течением с острым началом, лихорадкой, симптомами интоксикации, миалгиями и артралгиями, наличием пятнисто-папулезной сыпи и первичного аффекта, а также регионарного лимфаденита. Изменения со стороны периферической крови характеризовались преобладанием умеренной лимфопении и ускорением СОЭ. В биохимическом анализе крови зафиксировано увеличение активности ферментов более чем у 70% больных.
Впервые установлено, что на территории Алтайского края клещевой риккетсиоз может быть вызван двумя видами риккетсий: R. sibirica subsp. sibirica и R. heilongiangensis. СКТ, вызываемый R.sibirica subsp. sibirica, и дальневосточный клещевой риккетсиоз с этиологическим агентом R. heilongiangensis имеют сходную клиническую картину и могут давать перекрестную серологическую реакцию. Кроме того, на территории Алтайского края в клещах были выявлены другие патогенные риккетсии: R. raoultii и Candidatus R. tarasevichiae [8], что требует дальнейшего изучения этиологической структуры клещевых риккетсиозов.
Работа поддержана грантом ректора ФГБОУ ВО "Алтайский государственный медицинский университет" Минздрава России (договор № 3-гр), проект "Клинико-лабораторная характеристика клещевых инфекций в Алтайском крае".
ЛИТЕРАТУРА
1. Сведения о инфекционных и паразитарных заболевания (Форма 1) январь - декабрь 2013, 2014 гг. // Эпидемиология и инфекц. бол. 2015. № 2. С. 72-75.
2. Медянников ОЮ. Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевого риккетсиоза, вызываемого R. heilongjiangensis на Дальнем Востоке : автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2004.
3. Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., Самойленко И.Е., Ястребов В.К. Риккетсии и риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки в Сибири. Омск, 2012.
4. Гранитов В.М., Арсеньева И.В., Бесхлебова О.В., Дедков В.Г. и др. Первый клинический случай клещевого риккетсиоза, вызванный Rickettsia heilongjiangensis, на территории Сибири // Инфекционные болезни. 2014. № 3. С. 91-94.
5. Granitov V., Shpynov S., Beshlebova O., Arsenjeva I. et al. New evidence on tick-born rickettsioses in the Altai region of Russia using primary lesions, serum and blood clots of molecular and serological study // Microbes Infection. 2015. Vol. 17. P. 862-865.
6. Stenos J., Graves S., Unsworth N. A highly sensitive and specific real-time PCR assay for the detection of spotted fever and typhus group Rickettsiae // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2005. Vol. 73, N 6. P. 1083-1085.
7. Philip R.N., Casper E.A., MacCormack J.N., Sexton D. et al. A comparison of serologic methods for diagnosis of Rocky Mountain spotted fever // Am. J. Epidemiol. 1977. Vol. 105, N 1. P. 56-67.
8. Shpynov S., Fournier P.E., Rudakov N., Arsen'eva I. et al. Tick-borne rickettsiosis in the Altay region of Russia // Clin. Microbiol. Infect. 2009. Vol. 15, suppl. 2. P. 313-314.