Лабораторные методы диагностики ку-лихорадки и генотипирование Coxiella burnetii

• Фрейлихман Ольга Александровна
• Токаревич Николай Константинович
• Кондрашова Вероника Дмитриевна

РезюмеВ обзоре на основании данных литературы и многолетних результатов собственных исследований представлены современные сведения о лабораторных методах диагностики и генотипирования возбудителя ку-лихорадки. В зависимости от целей исследования рекомендован выбор различных методов обнаружения антител к C. burnetii или выявления этого возбудителя в различных биологических образцах. Проанализирована эффективность методов генотипирования C. burnetii, обладающих разной дискриминативной способностью, для решения эпидемиологических задач.

Ключевые слова:ку-лихорадка, Coxiella burnetii, иммунологические методы диагностики, молекулярно-генетические методы детекции, генотипирование

Ку-лихорадка для многих стран является важной ме­дико-социальной проблемой в силу широкого рас­пространения, профессионального характера болезни и значительных экономических потерь, обусловленных инфицированностью сельскохозяйственных животных, у кото­рых эта инфекция может вызывать аборты, мертворождение плода и рождение ослабленного потомства с выраженными патологическими изменениями [1-4]. Хроническая форма ку-лихорадки - весьма частый исход этого заболевания: например, на юге Франции от 5 до 8% всех случаев эндо­кардитов обусловлены C. burnetii - возбудителем лихорад­ки ку [5]. Такое развитие болезни у людей нередко приво­дит к инвалидизации, а в значительном количестве случаев и к летальному исходу [6]. Лечение коксиеллезного эндо­кардита требует длительного дорогостоящего комплексного терапевтического лечения, а в ряде случаев даже хирургиче­ского вмешательства [7-9].

Возбудитель ку-лихорадки обладает рядом общих фи­зиологических и морфологических свойств с представите­лями рода Rickettsia, что обосновывало существовавшую ранее классификацию возбудителя C. burnetii как пред­ставителя семейства Rickettsiaceae, порядок Rickettsiales. Дальнейшие филогенетические исследования, основанные на анализе гена 16S рибосомальной РНК, позволили пере­смотреть эту классификацию и переместить C. burnetii в по­рядок Legionellales, группу Gammaproteobacteria [10]. Таким образом, на данном этапе актуальной является следующая классификация: вид C. burnetii входит в состав рода Coxiella филы Proteobacteria класса Gammaproteobacteria, принад­лежащему порядку Legionellales семейства Coxiellaceae [11, 12].

Заболевания ку-лихорадкой людей и (или) природные и хозяйственные очаги этой инфекции выявлены практиче­ски во всем мире, за исключением, вероятно, Новой Зелан­дии [13]. К сожалению, далеко не везде официально реги­стрируют случаи ку-лихорадки. Как справедливо отметил J. Kazar [14], ее диагностируют во всех странах, где прово­дятся соответствующие исследования.

В России ку-лихорадка выявлена более чем в 50 субъ­ектах РФ [15]. С 1990 по 2015 г., по данным Роспотребнадзора, в России зарегистрировано 3178 случаев ку-лихорадки (см. рисунок).

Официальные данные о регистрации ку-лихорадки в Рос­сии не отражают реальное распространение этой инфекции. Об этом же свидетельствуют многочисленные данные лите­ратуры [16-18]. Одна из причин существенной гиподиагностики ку-лихорадки - трудности ее клинической диагностики, обусловленные выраженным полиморфизмом проявлений болезни и отсутствием патогномоничных симптомов. Значи­тельная гиподиагностика ку-лихорадки и, как следствие, не­рациональное лечение больных приводят, с одной стороны, к ее хронизации, с другой - к ошибочным представлениям о реальном распространении этой инфекции и отсутствию должной настороженности врачей к этой болезни.

Поэтому решающее значение в диагностике ку-лихорадки имеют специфические лабораторные методы.

Серологические методы диагностики ку-лихорадки

В настоящее время в России диагностика ку-лихорадки в подавляющем большинстве случаев осуществляется с по­мощью серологических методов. Инактивированные C. bu-rnetii, которые применяются для серологических реакций, могут находиться в разных фазовых состояниях аналогично энтеробактериям. Как известно, в естественных условиях (в организме клещей и животных) коксиеллы находятся в I фазе, при длительном лабораторном культивировании в развивающихся куриных эмбрионах или в клеточных куль­турах коксиеллы переходят во II фазу. Это определяется, в частности, формированием генетических вариантов, за­трагивающих структуру генов поверхностных липополисахаридов. Биологические свойства коксиелл, находящихся в разных фазовых состояниях, существенно различаются [19].

В ответ на заражение коксиеллами в организме человека на ранних стадиях инфекции образуются антитела на бел­ковые компоненты микробной клетки, так называемые анти­тела к коксиеллам II фазы. На поздней стадии острой инфекции или при хроническом течении болезни синтезируются антитела на липополисахаридные компоненты возбудителя, так называемые антитела к коксиеллам I фазы.

Как правило, для диагностики ку-лихорадки используют следующие серологические методы: реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию микроагглютинации (РМА), не­прямой метод флюоресцирующих антител (НМФА) и иммуно-ферментный анализ (ИФА) [20, 21].

С помощью РСК антитела выявляют на сравнительно поздних сроках болезни. Так, при исследовании сыво­роток крови больных во время вспышки ку-лихорадки в Воронежской области было показано, что к концу 3-й недели болезни этим методом удавалось определить анти­тела к коксиеллам Бернета II фазы лишь у 58,8±11,9% обследованных. Напротив, применение РА (реакция аг­глютинации) и НМФА позволило в эти сроки выявить соот­ветствующие антитела у 94,1±5,7% больных [22]. Данные o динамике уровня антител к коксиеллам Бернета у боль­ных ку-лихорадкой, выявляемого с помощью НМФА, в зна­чительной степени совпадали с результатами исследования сывороток крови, полученных в период большой вспышки ку-лихорадки в Нидерландах [23]. Иммунологический от­вет, определяемый с помощью НМФА, у больных, зара­женных коксиеллами Бернета, существенно различался. Как правило, антитела к коксиеллам II фазы выявлялись раньше, уровень титров антител был выше и длительность их обнаружения была продолжительнее, чем к коксиеллам I фазы [24, 25].

Классический вариант постановки РА позволял выяв­лять антитела на более ранних сроках болезни, чем РСК, од­нако широкое применение этой реакции было ограничено из-за существенных материальных затрат, обусловленных большим расходом дорогостоящего антигена. С целью сни­жения стоимости диагностического исследования и повы­шения чувствительности реакции Н.И. Амосенкова [26] и П.С. Барбан и соавт. [27] использовали коксиеллы Бернета, меченные изотиоционатом флюоресцеина. P. Fiset [28], J. Kazar [29], В.И. Самитова и Н.К. Токаревич [30] окра­шивали коксиеллезный антиген гематоксилином для ре­акции микроагглютинации (РМА). Хотя эти варианты РМА обладали большей чувствительностью, чем РСК, выявляли антитела к коксиеллам Бернета II фазы на сравнительно ранних сроках болезни и значительно экономили время на постановку реакции, они не нашли распространения, так как не было налажено производство соответствующих диагностикумов.

Следующим шагом на пути усовершенствования сероло­гической диагностики ку-лихорадки была разработка и ис­пытание ИФА [31-33]. В отличие от большинства исследо­вателей, применявших в иммуноферментных тест-системах для обнаружения антител корпускулярный антиген II фазы коксиелл, использование для сенсибилизации планшетов HCI гидролизного антигена I фазы коксиелл позволило зна­чительно повысить чувствительность ИФА за счет простран­ственной демаскировки антигена коксиелл II фазы при со­хранении или даже активации антигена I фазы. ИФА на основе разработанной тест-системы обладал значительно большей чувствительностью по сравнению с другими серологическими тестами. Установлено, что при сравнении результа­тов исследования сывороток крови больных ку-лихорадкой и реконвалесцентов (от 1-й недели болезни до 4 лет) по­сле заболевания антитела к коксиеллам были выявлены в 97±1,7; 91±3,3; 87±2,8 и 63±4,8% случаев с помощью ИФА, НМФА, РА и РСК соответственно. ИФА позволяет обнаруживать антитела к коксиеллам как на ранних сроках ку-лихорадки, так и на протяжении ряда лет после перенесения заболева­ния, что обосновывает применение этого метода не только для лабораторной диагностики, но и для сероэпидемиологического надзора за инфекцией [34]. Высокая чувствительность разработанной тест-системы для ИФА была подтверждена при исследовании сывороток крови добровольцев, иммуни­зированных инактивированной комбинированной вакциной против ку-лихорадки. Уже через 14 дней после вакцинации с помощью ИФА антитела к коксиеллам были выявлены у 70% вакцинированных. На этот срок в НМФА и РСК соот­ветствующие антитела были определены лишь в 40 и 15% со­ответственно. Большая чувствительность ИФА по сравнению с другими тестами была показана и на более поздних сро­ках после иммунизации волонтеров [35]. Данные о высо­кой чувствительности ИФА были недавно подтверждены польскими исследователями, показавшими, что при ис­следовании сывороток крови, полученных от сельско­хозяйственных рабочих, антитела к коксиеллам Бернета в РСК выявлены в 15,2%, а с помощью НМФА и ИФА в 31,1% и 39,1% проб соответственно [36]. Многие исследова­тели считают, что ИФА обладает высокой специфичностью и реже дает ложноположительные результаты при исследо­вании на ку-лихорадку, чем другие серологические методы [34, 37, 38]. ИФА с применением антигенов из коксиелл Бернета I и II фазы с успехом используют и при исследо­вании сывороток крови крупного рогатого скота. В Китае с помощью ИФА была установлена инфицированность сель­скохозяйственных животных возбудителем ку-лихорадки в 33% случаев [39].

Для лабораторной диагностики случаев острого коксиеллеза исследование сыворотки крови больного целесо­образно проводить в первые дни лихорадочного периода бо­лезни. Отрицательные результаты серологических реакций или низкие титры антител к коксиеллам II фазы обосновы­вают необходимость проведения повторного исследования сыворотки крови, полученной от больного, через 7-10 дней после забора первой пробы и сравнение результатов одно­временного исследования двух проб. Появление антител к коксиеллам Бернета II фазы или нарастание титров этих антител во второй пробе в 4 раза и более свидетельствует о коксиеллезной природе заболевания.

Дифференциация антител по классам иммуноглобулинов позволяет судить о сроках инфицирования коксиеллами. Об­наружение IgM- и IgG-антител к коксиеллам II фазы с помо­щью НМФА или ИФА на ранних сроках болезни, как правило, позволяет распознать коксиеллезную этиологию болезни без повторного исследования сыворотки крови в динамике инфекционного процесса. Выявление высоких титров IgG-антител (≥1:800 в НМФА) к коксиеллам Бернета I фазы явля­ется показателем хронической инфекции [19, 40]. Для диа­гностики хронического течения ку-лихорадки недавно была предложена модификация НМФА (InoDiag), представляющая полностью автоматизированный мультиплексный анализ де­текции IgM- и IgG-антител [41].

У сельскохозяйственных животных ку-лихорадка часто протекает в форме хронической инфекции, поэтому были предложены диагностические препараты, выявляющие анти­тела к коксиеллам Бернета I фазы. К ним относятся корпу­скулярный антиген коксиелл Бернета I фазы и эритроцитарные диагностикумы для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции непрямого гемолиза (РНГ). Наблюдение в динамике за инфицированным стадом овец позволило установить, что в ранний период эпизоотии в сыворот­ках крови животных преобладали антитела к коксиеллам II фазы, а спустя 1 год в тех же стадах чаще (как правило, не менее чем в 2 раза) определялись антитела к коксиеллам I фазы. Эти эпизоотологические наблюдения согла­суются с результатами экспериментальных исследований относительно динамики антител к коксиеллам I и II фазы у многократно инфицированных лабораторных животных [42-44].

Серологические методы длительное время являлись "золотым стандартом" лабораторной диагностики ку-лихорадки у человека [13]. Однако существенным ограничением использования этих методов является сравнительно позд­нее, после развития первых симптомов болезни, выявление антител [19, 45]. Этого недостатка лишены иммунологиче­ские и обладающие высокой чувствительностью и специфич­ностью амплификационные методы выявления коксиелл Бернета.

Выявление коксиелл Бернета иммунологическими методами

В соответствии с методическими рекомендациями "Се­рологические методы диагностики риккетсиозов" [46] вы­явление коксиелл в биологических объектах, в том числе в клиническом материале, осуществляется с помощью пря­мого метода флюоресцирующих антител (ПМФА) или в ре­акции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом. Однако примене­ние этих методов в практических лабораториях крайне за­труднительно, так как соответствующие диагностические препараты в России не выпускаются в промышленном мас­штабе, равно как и диагностические препараты для серо­диагностики лихорадки ку, однако при необходимости их производство может быть восстановлено, так как разрабо­тана необходимая техническая документация. В настоящее время для выявления коксиелл Бернета может быть исполь­зована разработанная в Институте им. Луи Пастера (Санкт-Петербург) иммуноферментная тест-система для обнаруже­ния коксиеллезных антигенов, рекомендованная для при­менения в практическом здравоохранении. Тест-система выявляет антигены коксиелл Бернета в биологическом ма­териале за счет их связывания с поликлональными антите­лами, сорбируемыми на поверхности лунок стрипов. Дан­ная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять 10-50 нг/мл корпускулярного антигена коксиелл Бернета I фазы, что составляет 3,78х10⁵-1,89х10⁶ клеток возбудителя в 1 мл. Ее чувствительность превосходит чувстви­тельность ПМФА более чем в 6-12 раз, а чувствительность РНГА более чем в 16-32 раза [47, 48].

Амплификационные методы выявления коксиелл Бернета

Амплификационные методы направлены на детекцию ДНК C. burnetii, используют в качестве мишеней гены, ко­дирующие различные бактериальные белки и нетранскрибируемые регионы вне зависимости от жизнеспособности возбудителя.

На данном этапе наиболее широко применяются методы ПЦР и ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ). С их помощью осуществляется детекция C. burnetii в различных биологических образцах, включая клинические: материал из сердечных клапанов, сосудистой аневризмы, биоптат печени, молоко, плаценту, ткани плода и плодную жидкость, сыво­ротку крови [49], кровь [50] и в целях санитарно-гигиениче­ского контроля в образцах продуктов питания, пробах воды [51], а также для идентификации патогена в естественных резервуарах [52, 53].

Впервые детекция C. burnetii молекулярно-биологическими методами была проведена в 1990 г. Тогда был предложен метод специфической гибридизации меченого ДНК-зонда с нуклеиновыми кислотами клинического об­разца [54]. Метод позволял определять наличие 16S рибосомальной РНК и плазмидных ДНК в крови, моче, тканевых образцах в количестве до 10 микробных клеток.

В последующем же, начиная с 1992 г., когда D. Raoult и соавт. впервые применили ПЦР для обнаружения C. burnetii в крови больных ку-лихорадкой [10], ПЦР долгое время оставалась основным методом молекулярной детекции воз­будителя.

Выявление коксиелл Бернета с помощью метода стандартной полимеразной шепной реакшии

К настоящему времени в качестве мишеней для детекции C. burnetii с помощью метода стандартной ПЦР описан ряд фрагментов генома, включающий как плазмидные после­довательности [55], так и нуклеотидные последовательно­сти, представленные на хромосоме: гены 16S rRNA [56, 57], 23S rRNA [58], внутренний транскрибируемый спейсер 16S-23S rRNA [59], гены sod [10], CbbE [60], rpoB [61], com1 [62] и icd [63], groEL [64].

Существует также диагностическая система, аналогично системе IS1111 для ПЦР-РВ, основанная на амплификации повторяющегося элемента - IS30A, но она обладает сравни­тельно меньшей чувствительностью [65].

Есть опыт применения ПЦР, когда данный метод благодаря специфичности мишени позволял, помимо детекции, осуще­ствить и типирование. Ген, кодирующий белок наружной мем­браны, ассоциированный с так называемыми "острыми" слу­чаями ку-лихорадки - adaA (acute disease antigen A), - был предложен в качестве мишени для молекулярной диагностики с целью подтверждения острой стадии болезни [62].

Выявление коксиелл Бернета с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Метод ПЦР-РВ, обладая преимуществами одновременной детекции и количественной оценки возбудителя в образце, а также благодаря ряду таких качеств, как более высокая чувствительность и специфичность, короткий период полу­чения результата исследования, начал вытеснять метод стан­дартной ПЦР из рутинной диагностики.

Для детекции C. burnetii ПЦР-РВ была впервые при­менена в 2003 г. Для исследования образцов крови был предложен быстрый метод "гнездового" ПЦР - LCN-PCR -с использованием прибора Light Cycler (Roche). В нем ис­пользовались две пары праймеров с разной температурой гибридизации, подобранные к разным участкам многокопийного гена транспозазы IS1111, причем весь процесс ам­плификации составил всего 90 мин. Специфичность LCNPCR достигала 100%, а чувствительность - до 1 клетки возбу­дителя [66]. В дальнейшем применялись другие методики, в частности технология с использованием интеркалирующего красителя (SYBRGreen I) [67, 68] и технология с использованием флуоресцентных зондов (TaqMan) [69]. Исследования были направлены на изучение чувствитель­ности C. burnetii к различным антибиотикам, установле­ние порога чувствительности метода ПЦР-РВ, детекцию C. burnetii в молоке и в молочных продуктах [70], клиниче­ских образцах.

В настоящее время для различных научных и практиче­ских задач, связанных с определением C. burnetii в матери­але с помощью ПЦР-РВ, в качестве мишени для праймеров используются различные гены, при этом ген транспозазы IS1111 неизменно остается наиболее часто используемой диагностической мишенью [71-73]. Применение праймеров и зонда для детекции фрагмента гена транспозазы, который входит в состав инсерционного домена высокой копийности (от 8 до 31 повтора на хромосому), позволяет зна­чительно повысить чувствительность ПЦР-РВ. В частности, E.C Angelakis и соавт. рекомендуют ПЦР-РВ с использова­нием мишени IS1111 для детекции возбудителя в первые 2 нед заболевания у пациентов с эндокардитами или сосуди­стой инфекцией [74-76]. P.M. Schneeberger и соавт. исполь­зовали мишень IS1111 для целей диагностики ку-лихорадки на ранних стадиях инфекции в период вспышки заболева­ния в Нидерландах в 2007-2009 гг., при этом своевремен­ная лабораторная диагностика в большом числе случаев позволила добиться уменьшения продолжительности за­болевания благодаря оптимизации сроков начала лечения и повышения его специфичности [49]. Для повышения эф­фективности детекции коксиеллы в образцах, полученных от животных и из внешней среды на территории ферм, по­раженных во время вспышки ку-лихорадки в Нидерландах, de Bruin и соавт. в 2011 г. была предложена мультиплекс­ная ПЦР-РВ, включающая детекцию трех геномных локусов C. burnetii - фрагментов генов icd, com1 и IS1111, которая продемонстрировала высокую чувствительность и специ­фичность [77].

Генотипирование коксиелл Бернета

Дифференциация штаммов C. burnetii и характеристика популяции этого возбудителя сопряжены с определенными трудностями и имеют ряд особенностей, которые связаны с трудоемкостью и длительностью культивирования коксиеллы в условиях лаборатории; с ограничениями при обмене штаммами между лабораториями из-за высокой патогенности возбудителя, а также с тем, что C. burnetii как микро­организму с предположительно недавним становлением в качестве патогена человека свойственна низкая степень гетерогенности внутри вида. С этим связана необходимость поиска методов генетической характеристики популяции этого возбудителя, обладающих максимальной дискриминативной способностью. На данном этапе, несмотря на наличие методов и подходов, позволяющих генотипировать штаммы и изоляты С. burnetii, как правило, только их сочетание от­вечает требованиям релевантности исследования.

Для дифференциации штаммов и изолятов C. burnetii в зависимости от источника инфекции, патогенности возбу­дителя и биологического вида хозяина было разработано до­вольно большое число методов. Но для многих из данных ме­тодов, в частности основанных на секвенировании гена 16S рРНК, 16S-23S рибосомальной ДНК, внутреннего транскриби­руемого спейсера и гена rpoB, кодирующего β-субъединицу РНК полимеразы, результаты оказались малозначимыми в силу недостаточной дискриминативной силы использован­ных методик применительно к C. burnetii [10, 59, 61].

Были предприняты также попытки использовать с целью оценки степени геномного полиморфизма возбудителя ряд других маркерных генов C. burnetii. Незначительные различия в популяции бактерии были выявлены при сравнении у разных штаммов C. burnetii последовательностей гена изоцитратдегидрогеназы (icd) [63], гена djlA, обеспечивающего реализацию мукоидных свойств наружной мембраны возбудителя [50] и гена com1, кодирующего белок с гипотетической функцией [62].

Также на раннем этапе подходов к генотипированию были предприняты попытки дифференцировать штаммы C. burnetii по их плазмидному типу [51, 78] и путем анализа полимор­физма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), разделенных в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на­трия (SDS-PAGE) [79] или с помощью пульс-гель-электрофореза (PFGE) [80-82]. В целом метод RFLP долгое время оставался одним из наиболее применимых для молекулярно-генетической характеристики штаммов C. burnetii с начала 1990-х до начала 2000-х гг. Материалом для проведения рестрикционного анализа может служить не только тотальная ДНК C. burnetii, но и амплифицированные в процессе ПЦР геном­ные фрагменты меньшей длины. Наиболее ощутимым не­достатком метода является его субъективность, что связано с необходимым, но на практике трудновыполнимым условием хорошего разделения фрагментов при сравнении рестрикционных профилей штаммов в PFGE [56, 86]. Метод RFLP был применен при анализе штаммов C. burnetii российской коллекции, и, согласно результатам этого исследования, они представляют однородную группу. Тем не менее наблюдались различия в рестрикционных профилях отечественных штам­мов по сравнению с западноевропейскими [83].

В дальнейшем начиная с середины 2000-х гг. благодаря появлению данных о последовательности генома C. burnetii и расширению методических возможностей стало доступно применение таких методов, как, например, ДНК-гибридизация на микрочипах, позволяющая выявлять полиморфизмы в от­крытых рамках считывания, локализованных на хромосоме или на плазмиде, и определять генетический профиль штам­мов, основываясь на информации об отсутствии или наличии генов, формирующих геномотип (авторами выявлено 7 геномотипов при исследовании 24 изолятов) [84, 85]. И хотя некоторые выявленные геномотипы позволяли установить связь особенностей организации генома со специфичностью к организму хозяина и с вирулентностью, сложность воспро­изведения такого исследования ограничивает его примене­ние в области клинической лабораторной диагностики. На данном этапе широко применяются методы, использующие подход, включающий анализ и сравнение нуклеотидных по­следовательностей, основываясь на полиморфизме изуча­емых локусов. В числе таких методов можно назвать метод, основанный на селективной амплификации расщеплен­ных эндонуклеазами рестрикции фрагментов [Infrequent Restriction Site-(IRS)-PCR] [86], метод типирования по числу копий мобильного элемента IS1111 (IS1111-Typing) [71], метод типирования по особенностям однонуклеотидных полиморфизмов [Single Nucleotide Polymorphism (SNP) -Typing] [87]. Каждый из перечисленных методов позволил охарактеризовать ту или иную группу штаммов C. burnetii раз­личными исследовательскими коллективами, но в качестве наиболее высокодискриминативных, относительно доступ­ных и универсальных методов генотипирования C. burnetii широко используются метод мультиспейсерного типирования (MST) [88] и метод анализа множественных локусов гиперва­риабельных минисателлитов (VNTR) (MLVA) [89].

Метод MLVA достаточно широко применяется для характе­ристики изолятов и штаммов C. burnetii, выделяемых от чело­века, из объектов внешней среды, продукции животного про­исхождения, крови сельскохозяйственных животных, при этом количество определяемых этим методом новых генотипов по­стоянно возрастает [90-93]. Метод нашел применение в ходе эпидемиологического анализа при вспышках ку-лихорадки в ряде стран, показывая высокие дискриминационные воз­можности, но существенным недостатком метода являются возможные различия в воспроизводимости паттерна ампликонов вариабельных локусов в различных лабораториях [86].

Метод MST, впервые примененный в 2005 г. [88], основан на определении связи между последовательностью множе­ственных межгенных промежутков, определенной методом секвенирования, расположенных между открытыми рамками считывания, и географическим происхождением штамма. Тем самым достигается одно из основных достоинств метода MST, связанное с использованием потенциально высокова­риабельных мишеней, не подвергающихся эволюционному давлению, обусловливая лучшую дифференциацию штаммов внутри консервативных биологических видов. Метод по­зволяет дифференцировать штаммы C. burnetii различного географического происхождения в целях изучения эпиде­миологии ку-лихорадки, а однозначность интерпретации результатов секвенирования и их доступность в Интернете позволяют сравнивать данные такого рода, полученные в различных лабораториях, без необходимости обмена опасным биологическим материалом. Этот метод может быть успешно применен для отслеживания происхожде­ния штаммов, что будет наиболее актуальным при рас­шифровке эпидемических вспышек ку-лихорадки, вклю­чая возможные последствия актов биотерроризма. Второй важнейшей задачей метода является изучение эволюцион­ных генетических изменений возбудителя [94]. Метод на­шел широкое применение для генотипирования штаммов и изолятов С. burnetii, выделенных из различных типов био­логических образцов на различных территориях [95, 96]. В частности с помощью метода MST была изучена генети­ческая структура популяции С. burnetii, представленной штаммами, выделенными из различных источников инфек­ции в ряде регионов России. Установлено, что популяции C. burnetii на территории России свойственна относитель­ная генетическая однородность. Подавляющее большин­ство штаммов (85%) C. burnetii, выделенных в различных регионах России, принадлежит к генотипу ST23 (монофилетическая группа II). К этой группе штаммов филогене­тически наиболее близки штаммы европейского проис­хождения (генотипы ST18, ST22, ST25 и ST29). Ряд штаммов, имеющих завозное происхождение, обладают уникальным для российской популяции генотипом ST7 (монофилетическая группа I) [88, 97].

Таким образом, в последние годы происходит быстрое развитие методов молекулярного типирования С. burnetii, и уже возникала возможность оценить их значимость во время вспышки ку-лихорадки в Нидерландах. Тем не менее, учитывая немногочисленное количество лабораторий, за­действованных в работе с С. burnetii, разработка и широ­кое применение методов типирования происходят гораздо в меньшем объеме, чем, например, при работе со S. aureus или M. tuberculosis. Поэтому на данном этапе поиск "золо­того стандарта" генотипирования С. burnetii по-прежнему является актуальной задачей, решению которой, в частно­сти, может служить стремительно развивающаяся техноло­гия секвенирования следующего поколения, обладающая большим потенциалом в области поиска маркеров и методов генотипирования С. burnetii путем расширения информаци­онной базы данных о геноме C. burnetii.

ЛИТЕРАТУРА

1. Arricau-Bouvery N., Rodolakis A. Is Q fever an emerging or re-emerging zoonosis? // Vet. Res. 2005. Vol. 36, N 3. P. 327-349.

2. European Food Safety Authority (EFSA). Scientific opinion on Q fever // EFSA J. 2010. Vol. 8, N 5. P. 1595.

3. Georgiev M., Afonso A., Neubauer H. et al. Q fever in humans and farm animals in four European countries, 1982 to 2010 // Euro Surveill. 2013. Vol. 18, N 8. pii: 20407.

4. Guatteo R., Seegers H., Taurel A.F. et al. Prevalence of Coxiella burnetii infection in domestic ruminants: A critical review // Vet. Microbiol. 2011. Vol. 149, N 1-2. P. 1-16.

5. Tissot-Dupont H., Raoult D., Brouqui P. et al. Epidemiologic features and clinical presentation of acute Q fever in hospitalized patients - 323 French cases // Am. J. Med. 1992. Vol. 93. P. 427-434.

6. Raoult D., Tissot-Dupont H., Foucalt C. Q fever 1985-1998: clinical and epidemiologic features of 1,383 infections // Medicine (Baltimore). 2002. Vol. 79. P. 109-123.

7. Токаревич Н.К. Активность лекарственных препаратов в отно­шении Coxiella burnetii - возбудителя Ку-лихорадки // Антибиотики и химиотер. 2007. № 1-2. С. 46-56.

8. Яковлев Э.А., Лукин Е.П., Борисевич С.В. Химиотерапия и химиопрофилактика риккетсиозов и коксиеллеза на современном этапе // Антибиотики и химиотер. 2011. Т. 56, № 11-12. С. 34-44.

9. Marrie T.J. Coxiella burnetii (Q fever) // Principles and Practice of Infectious Diseases. New York, 1995. P. 1727-1734.

10. Stein A., Raoult D. Detection of Coxiella burnetti by DNA amplification using polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. Vol. 30, N 9. P. 2462-2466.

11. Seshadri R., Paulsen I.T., Eisen J.A. et al. Complete genome sequence of the Q-fever pathogen Coxiella burnetii // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 5455-5460.

12. Thompson С.С. et al. Microbial genomic taxonomy // BMC Genomics. 2013. Vol. 14. P. 913. doi: 10.1186/1471-2164-14-913.

13. Fournier P.E., Marrie T.J., Raouit D. Diagnosis of Q fever // J. Clin. Microbiol. 1998. Vol. 36, N 7. P. 1823-1834.

14. Kazar J. Q Fever. Institute of Microbiology, Bulgarian Academy of Sciences, 2007. P. 243-254.

15. Тарасевич И.В., Фетисова Н.Ф., Макарова В.А. и др. Риккетсиозы // Природная очаговость болезней: исследования Института Га­малеи РАМН. СПб., 2003. С. 64-98.

16. Рудаков Н.В., Фетисова Н.Ф., Сыскова Т.Г. Коксиеллез в россий­ской Федерации // Здоровье населения и среда обитания. 1994. № 2. С. 10-12.

17. Фетисова Н.Ф., Гафарова М.Т. Эколого-эпидемиологические аспекты коксиеллеза // Вестн. РАМН. 2008. № 7. С. 15-18.

18. Tokarevich N., Freilykhman O.A., Titova N.M., Zheltakova I.R. Anthropogenic effects on changing Q fever epidemiology in Russia // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. Vol. 1078. P. 120-123.

19. Maurin M., Raoult D. Q fever // Clin. Microbiol. Rev. 1999. Vol. 12, N 4. P. 518-553.

20. Herremans T., Hogema B.M., Nabuurs M. et al. Comparison of performance of IFA, CFA and ELISA assys for the serodiagnosis of acute Q fever by quality assessment // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2013. Vol. 75. P. 16-21.

21. La Scola B. Current laboratory diagnosis of Q fever // Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2002. Vol. 13. P. 257-262.

22. Токаревич Н.К., Друганова Л.П., Дайтер А.Б., и др. Сочетанное применение серологических тестов с целью диагностики и изучения Ку риккетсиоза // Журн. микробиол. 1979. № 12. С. 90-95.

23. Wielders C.C.H., Teunis P.F.M., Hermans M.H.A. et al. Kinetics of antibody response to Coxiella burnetii infection (Q fever): Estimation of the seroresponse onset from antibody levels // Epidemics. 2015. Vol. 13. P. 37-43.

24. Teunis P.F.M., Schimmer, B., Notermans, D.W. et al. Time-course of antibody responses against Coxiella burnetii following acute Q fever // Epidemiol. Infect. 2013. Vol. 141. P. 62-73.

25. Wegdam-Blans M.C.A., Wielders C.C.H., Meekelenkamp J. et al. Evaluation of commonly used serological tests for detection of Coxiella burnetii antibodies in well-defined acute and follow-up sera // Clin. Vaccine Immunol. 2012. Vol. 19, N 7. P. 1110-1115.

26. Амосенкова Н.И. Реакция микроагглютинации с диагностикумом из риккетсий Бернета, меченными изотиоцианатом флюоресцина // Природноочаговые инфекции : тр. Института им. Пастера. 1973. № 41. С. 32-37.

27. Барбан П.С., Мирский В.Я., Катаева Т.В. Иммунофлюоресцентная реакция микроагглютинации риккетсий. Сообщение 2. Вы­явление антител к риккетсиям Бернета // Лаб. дело. 1975. № 5. С. 315.

28. Fiset P., Ormsbee R.A., Silberman R. et al. A microagglutination technique for detection and measurement of rickettsial antibodies // Acta Virol. 1969. Vol. 13, N 1. P. 60-66.

29. Kazar J., Brezina R., Schramek S. et al. Пригодность реакции микроагглютинации для определения постинфекционных и поствакци­нальных антител к лихорадке Ку в сыворотках человека // Acta Virol. 1981. Vol. 25. P. 235-240.

30. Самитова В.И., Токаревич Н.К. Антиген из коксиелл Бернета для реакции микроагглютинации // Природноочаговые болезни человека : респ. сб. науч. работ. Омск, 1985. С. 112-115.

31. Яблонская В.А., Кузнецова А.В. Непрямой твердофазный иммуноферментный метод (НТИФМ) в диагностике риккетсиозов // Риккетсиозы : сб. науч. тр. Института им. Пастера. 1989. № 66. С. 137-139.

32. Doller G., Doller P.C., Gerth H.J. Early diagnosis of Q fever: Detection of Immunoglobulin M by Radioimmunoassay and Enzyme Immunoassay // Eur. J. Clin. Microbiol. 1984. Vol. 3, N 6. P. 550-553.

33. Gracea E., Constantinescu S., Dimitrescu A. et al. Q-fever serum diagnosis by immunoenzymatic (ELISA) test // Arch. Roum. Pathol. Exp. Microbiol. 1983. Vol. 42. P. 283-288.

34. Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К. Изучение иммунного ответа у больных и переболевших Ку-лихорадкой при использовании иммуноферментного анализа // Журн. микробиол. 1995. № 3. С. 99-102.

35. Krutitskaya L., Tokarevich N., Zhebrun A. et al. Autoimmune component in individuals during immune response to inactivated combined vaccine against Q fever // Acta Virol. 1996. Vol. 40. P. 173-177.

36. Szymanska-Czerwinska M., Galinska E.M., Niemczuk K., Knap J.P. Prevalence of Coxiella burnetii infection in humans occupationally exposed to animals in Poland // Vector Borne Zoonotic Dis. 2015. Vol. 15, N 4. P. 261-267.

37. Peter O., Dupuis G., Peacock M.G., Burgdorfer W. Comparison of enzyme-linked immuno-sorbent assay and complement fixation and indirect fluorescent-antibody tests for detection of Coxiella burnetii antibody // J. Clin. Microbiol. 1987. Vol. 25. P. 1063-1067.

38. Waag D.M., Bolt C.R., Marrie T.J., Williams J.C. Q Fever: The Biology of Coxiella burnetii. Boca Raton, 1991. P. 164-167.

39. El-Mahallawy H.S., Kelly P., Zhang J. et al. High seroprevalence of Coxiella burnetii in dairy cattle in China // Trop. Anim. Health Prod. 2016. Vol. 48, N 2. P. 423-426.

40. Frankel D., Richet H., Renvoise A., Raoult D. Q fever in France, 1985-2009 // Emerg. Infect. Dis. 2011. Vol. 17. P. 350-356.

41. Bizzini A., Peter O., Baud D. et al. Evaluation of a new serological test for the detection of anti-Coxiella and anti-Rickettsia antibodies // Microbes Infection. 2015. Vol. 17, N 11-12. P. 811-816.

42. Дайтер А.Б., Токаревич Н.К., Рудаков Н.В., Носков Ф.С. Приме­нение антигена из Coxiella burnetii 1-й фазы и эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума для повышения эффективностиности эпидемиологической разведки в отношении Ку-риккетсиоза // Журн микробиол. 1985. № 10. С. 105-106.

43. Токаревич Н.К., Шрамек С., Баяр Г.А. Испытание эритроцитарного антигенного диагностикума для выявления антител к коксиеллам Бернета // Журн. микробиол. 1985. № 4. С. 51-55.

44. Tokarevich N.K., Schramek S., Daiter A.B. Indirect haemolysis test in Q Fever // Acta Virol. 1990. Vol. 34. P. 358-360.

45. Anderson A., Bijlmer H., Fournier P.E. et al. Diagnosis and management of Q fever - United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group // MMWR Recomm. Rep. 2013. doi: rr6203a1.

46. Серологические методы диагностики риккетсиозов. Методиче­ские рекомендации. М., 1988. 48 с.

47. Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К., Вербов В.Н. и др. Иммуноферментный метод индикации антигенов коксиелл Бернета // Журн. микробиол. 1991. № 2. С. 56-60.

48. Токаревич Н.К. Проблемы коксиеллеза на рубеже третьего ты­сячелетия // Актовая речь. СПб., 2001. С. 1-37.

49. Schneeberger P.M., Hermans M.H., van Hannen E.J. et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever // Clin. Vaccine Immunol. 2010. Vol. 17, N 2. P. 286-290.

50. Sekeyova Z., Roux V., Raoult D. Intraspecies diversity of Coxiella burnetii as revealed by com1 and mucZ sequence comparison // FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol. 180. P. 61-67.

51. Willems H., Thiele D., Frolich-Ritter R., Krauss H. Detection of Coxiella burnetii in cow's milk using the polymerase chain reaction (PCR) // Zentralbl. Veterinarmed. B. 1994. Vol. 41. P. 580-587.

52. Tissot-Dupont H., Torres S., Nezri M., Raoult D. A hyperendemic focus of Q fever related to sheep and wind // Am. J. Epidemiol. 1999. Vol. 150. P. 67-74.

53. Beaman M.H., Hung J. Pericarditis associated with tick-borne Q fever // Aust. N. Z. J. Med. 2000. Vol. 19. P. 254-256.

54. Frazier M.E., Mallavia L.P., Samuel J.E., Baca O.G. DNA probes for the identification of Coxiella burnetti strains // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. Vol. 590. P. 445-458.

55. Mallavia L.P., Whiting L.L., Minnick M.F. et al. Strategy for detection and differentiation of Coxiella burnetii strains using the polymerase chain reaction // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. Vol. 590. P. 572-581.

56. Afseth G., Mallavia L.P. Copy number of the 16S rRNA gene in Coxiella burnetii // Eur. J. Epidemiol. 1997. Vol. 13, N 6. P. 729-731.

57. Masuzawa T., Sawaki K., Nagaoka H., Akiyama M. et al. Identification of Rickettsiae isolated in Japan as Coxiella burnetii by 16S rRNA sequencing // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. Vol. 47, N 3. P. 883-884.

58. Ibrahim A., Norlander L., Macellaro A., Sjostedt A. Specific detection of Coxiella burnetii through partial amplification of 23S rDNA // Eur. J. Epidemiol. 1992. Vol. 13, N 3. P. 329-334.

59. Stein A., Kruszewska D., Gouvernet J., Raoult D. Study of the 16S-23S ribosomal DNA internal spacer of Coxiella burnetii // Eur. J. Epidemiol. 1997. Vol. 13, N 4. P. 471-475.

60. Stein A., Raoult D. Lack of pathotype specific gene in human Coxiella burnetii isolates // Microb. Pathog. 2003. Vol. 15, N 3. P. 177-185.

61. Mollet C., Drancourt M., Raoult D. Determination of Coxiella burnetii rpoB sequence and its use for phylogenetic analysis // Gene. 1998. Vol. 207, N 1. P. 97-103.

62. Zhang G., To H., Russell K.E. et al. Identification and characterization of an immunodominant 28-kDa Coxiella burnetii outer membrane protein specific to isolates associated with acute disease // Infect. Immun. 2005. Vol. 73. P. 1561-1567.

63. Nguyen S., Hirai K. Differentiation of C. burnetii isolates by sequence determination and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of isocitrate dehydrogenase gene // FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol. 180. P. 249-254.

64. Фрейлихман О.А., Панферова Ю.А., Токаревич Н.К. Совершен­ствование метода детекции Coxiella burnetti в биологическом материале на основе имплификации гена groEL // Журн микробиол. 2010. № 4. С. 71-74.

65. Eldin C., Angelakis E., Renvoise A., Raoult D. Coxiella burnetii DNA, but not viable bacteria, in dairy products in France // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2013. Vol. 88, N 4. P. 765-769.

66. Fournier P.E., Raoult D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41, N 11. P. 5094-5098.

67. Boulos A., Rolain J.M., Raoult D. Measurement of the antibiotic susceptibility of Coxiella burnetii using real time PCR // Int. J. Antimicrob. Agents. 2004. Vol. 23, N 2. P. 169-174.

68. Brennan R.E., Samuel J.E. Evaluation of C. burnetii antibiotic susceptibilities by real-time PCR assay // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41. P. 1869-1874.

69. Klee S., Tyczka J., Ellebrok H. et al. Highly sensitive real-time PCR for specific detection and quantification of C. burnetii // BMC Microbiol. 2006. Vol. 2. P. 338-345.

70. Guatteo R., Beaudeau F., Joly A., Seegers H. Assessing the withinherd prevalence of Coxiella burnetii milk-shedder cows using a real-time PCR applied to bulk tank milk // Zoonoses Public Health. 2007. Vol. 54, N 5. P. 191-194.

71. Denison A.M., Thompson H.A., Massung R.F. IS1111 insertion sequences of Coxiella burnetii: characterization and use for repetitive element PCR-based differentiation of Coxiella burnetii isolates // BMC Microbiol. 2007. Vol. 7. P. 91.

72. Panning М., Kilwinski J., Greiner-Fischer S. et al. High throughput detection of Coxiella burnetii by real-time PCR with internal control system and automated DNA preparation // BMC Microbiol. 2008. Vol. 8. P. 77.

73. Tissot-Dupont H., Raoult D. Q fever // Infect. Dis. Clin. North Am. 2008. Vol. 22, N 3. P. 505-514.

74. Angelakis E., Mediannikov O., Socolovschi C. et al. Coxiella burnetii-positive PCR in febrile patients in rural and urban Africa // Int. J. Infect. Dis. 2014. Vol. 28. P. 107-110.

75. Grisoli D., Million M., Edouard S. et al. Latent Q fever endocarditis in patients undergoing routine valve surgery // J. Heart Valve Dis. 2014. Vol. 23, N 6. P. 735-743.

76. Mediannikov O., Fenollar F., Socolovschi C. et al. Coxiella burnetii in humans and ticks in rural Senegal // PLoS Negl. Trop. Dis. 2010. Vol. 4, N 4. Article ID e654.

77. de Bruin A., de Groot A., de Heer L. et al. Detection of Coxiella burnetii in complex matrices by using multiplex quantitative PCR during a major Q fever outbreak in the Netherlands // Appl. Environ. Microbiol. 2011. Vol. 77, N 18. P. 6516-6523.

78. Valkova D., Kazar J. A new plasmid (QpDV) common to Coxiella burnetii isolates associated with acute and chronic Q fever // FEMS Microbiol. Lett. 1995. Vol. 125. P. 275-280.

79. Hendrix L.R., Samuel J.E., Mallavia L.P. Differentiation of Coxiella burnetii isolates by analysis of restriction-endonuclease-digested DNA separated by SDS-PAGE // J. Gen. Microbiol. 1991. Vol. 137. P. 269-276.

80. Heinzen R.A., Frazier M.E., Mallavia L.P. Nucleotide sequence of Coxiella burnetii superoxide dismutase // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18, N 21. P. 6437.

81. Jager C., Willems H., Thiele D., Baljer G. Molecular characterization of Coxiella burnetii isolates // Epidemiol. Infect. 1998. Vol. 120. P. 157-164.

82. Thiele D., Willems H., Kopf G., Krauss H. Polymorphism in DNA restriction patterns of Coxiella burnetii isolates investigated by pulsed field gel electrophoresis and image analysis // Eur. J. Epidemiol. 1993. Vol. 9. P. 419-425.

83. Демкин В.В., Токаревич Н.К., Рыдкина Е.Б. и др. Характеристика полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов Coxiella burnetii, выделенных на территории России // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. № 6. С. 13-16.

84. Beare P.A., Samuel J.E., Howe D., Virtaneva K. et al. Genetic diversity of the Q fever agent, Coxiella burnetii, assessed by microarraybased whole-genome comparisons // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188, N 7. P. 2309-2324.

85. Leroy Q., Armougom F., Barbry P., Raoult D. Genomotyping of Coxiella burnetii using microarrays reveals a conserved genomotype for hard tick isolates // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 10. Article ID e25781.

86. Arricau-Bouvery N., Hauck Y., Bejaoui A. et al. Molecular characterization of Coxiella burnetii isolates by infrequent restriction site-PCR and MLVA typing // BMC Microbiol. 2006. Vol. 6. P. 38.

87. Priestley R.A., Hornstra H.M., Pearson T. et al. The state of the SNP: using real-time PCR to genotype Coxiella burnetii // Abstract N 34, 23rd Meeting of the American Society for Rickettsiology. 2009.

88. Glazunova O., Roux V., Freylikman O. et al. Coxiella burnetii genotyping // Emerg. Infect. Dis. 2005. Vol. 11, N 8. P. 1211-1217.

89. Svraka S., Toman R., Skultety L. et al. Establishment of a genotyping scheme for Coxiella burnetii // FEMS Microbiol. Lett. 2006. Vol. 254, N 2. P. 268-274.

90. Astobiza I., Tilburg J.J., Pinero A. et al. Genotyping of Coxiella burnetii from domestic ruminants in northern Spain // BMC Vet. Res. 2012. Vol. 8. P. 241.

91. Ceglie L., Guerrini E., Rampazzo E. et al. Molecular characterization by MLVA of Coxiella burnetii strains infecting dairy cows and goats of north­eastern Italy // Microbes Infection. 2015. Vol. 17. P. 776-781.

92. Pinero A., Barandika J.F., Ana L. et al. Genetic diversity and variation over time of Coxiella burnetii genotypes in dairy cattle and the farm environment // Infect. Gen. Evol. 2015. Vol. 31. P. 231-235.

93. Racic I., Spicic S., Galov A. et al. Cvetnic Identification of Coxiella burnetii genotypes in Croatia using multi-locus VNTR analysis // Vet. Microbiol. 2014. Vol. 173. P. 340-347.

94. D'Amato F., Eldin K., Raoult D. The contribution of genomics to the study of Q fever // Future Microbiol. 2016. Vol. 11, N 2. P. 253-272.

95. Domenico M., Curini V., De Massis F. et al. Coxiella burnetii in Central Italy: Novel Genotypes Are Circulating in Cattle and Goats // Vect Borne Zoon Dis. 2014. Vol. 14, N 10. P. 710-715.

96. Kumsa B., Socolovschi C., Almeras L. et al. Occurrence and Genotyping of Coxiella burnetii in Ixodid Ticks in Oromia, Ethiopia // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2015. Vol. 93, N 5. P. 1074-1081.

97. Fournier P.E., Casalta J.P., Habib G. et al. Modification of the diagnostic criteria proposed by the Duke Endocarditis Service to permit improved diagnosis of Q fever endocoarditis // Am. J. Med. 1996. Vol. 100. P. 629-633.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)