В борьбе с инфекционными болезнями приоритетная роль принадлежит мероприятиям, направленным на раннее выявление возбудителей с целью предотвращения их массового распространения. В последние десятилетия наряду с расширением ареала уже известных инфекционных болезней, появлением и быстрым распространением новых и вновь возникающих инфекционных болезней отмечается тенденция роста чрезвычайных ситуаций (ЧС) санитарно-эпидемиологического характера, обусловленных последствиями природных и техногенных катастроф.
Сохраняется угроза применения патогенных биологических агентов (ПБА) в биотеррористических целях, чему в том числе способствует интенсивное развитие генной инженерии и синтетической биологии.
В арсенале средств борьбы с современными угрозами биологического характера одно из ведущих мест отведено лабораторной диагностике инфекционных болезней, включая индикацию ПБА. Эффективное выявление возбудителей опасных инфекционных болезней является решающим условием для своевременного назначения адекватного лечения больным, а также служит основанием для организации и проведения необходимого комплекса противоэпидемических мероприятий.
Санитарно-эпидемиологические правила по санитарной охране территории РФ от 2008 г. [1] требуют проведения мероприятий в отношении 16 нозологических форм инфекционных болезней: оспы, полиомиелита, гриппа, вызванного новым подтипом вируса, ТОРС, чумы, холеры, желтой лихорадки, лихорадок Ласса, Эбола, Марбург, малярии, крымской геморрагической лихорадки, лихорадки Западного Нила, лихорадки денге, лихорадки Рифт-Валли, менингококковой болезни. Положение о порядке осуществления санитарнокарантинного контроля в рамках Таможенного союза [2] регламентирует проведение мероприятий в отношении 24 форм инфекционных болезней: оспы, полиомиелита, гриппа, вызванного новым подтипом вируса, ТОРС, чумы, холеры, желтой лихорадки, лихорадок Ласса, Эбола, Марбург, малярии, крымской геморрагической лихорадки, лихорадки
Западного Нила, лихорадки денге, лихорадки Рифт-Валли, менингококковой болезни, сибирской язвы, бруцеллеза, сапа, мелиоидоза, эпидемического сыпного тифа, туберкулеза, лихорадок Хунин и Мачупо. Эти документы, как и Международные медико-санитарные правила (ММСП, 2005 г.), предусматривают возможность включения в перечень новых опасных инфекционных болезней.
Принимая во внимание требования вышеуказанных нормативных документов, лабораторная служба страны должна быть готова к обеспечению лабораторной диагностики широкого спектра инфекционных болезней, учитывая, что возбудители большинства из них относятся к категории особо опасных (микроорганизмы I или II группы патогенности) и опасных.
А для этого необходимы диагностические лаборатории с соответствующим уровнем биологической безопасности, оснащенные высокотехнологичным аналитическим оборудованием, широким спектром диагностических препаратов и питательных сред, зарегистрированных в установленном порядке, а также нормативно-методическое обеспечение проводимых работ и высокий уровень профессиональной подготовки кадров.
Лабораторную диагностику опасных инфекционных болезней в Российской Федерации осуществляют учреждения Роспотребнадзора: ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте РФ, противочумные учреждения, научно-исследовательские институты эпидемиологического и вирусологического профиля, государственные научные центры, а также профильные учреждения других ведомств. Все эти учреждения функционируют в рамках единой трехуровневой системы мониторинга и лабораторной диагностики опасных инфекционных болезней [3, 4]. Реализация федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 гг.)" обеспечила модернизацию лабораторной базы учреждений Роспотребнадзора.
Одним из аспектов модернизации стало совершенствование нормативно-методического обеспечения, регламентирующего проведение лабораторной диагностики и специфической индикации ПБА в рамках трехуровневой системы.
Осуществлена стандартизация лабораторной диагностики за счет создания единых методических алгоритмов лабораторных исследований, внедрения порядков организации и проведения лабораторной диагностики для лабораторий различного уровня (ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора в субъектах РФ, региональными и рефернс-центрами по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней). В деятельность лабораторий, осуществляющих диагностику особо опасных инфекционных болезней, внедрен международный стандарт ISO-ГОСТ ИСО МЭК 17025 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".
Закрепленные в нормативно-методических документах дифференцированные подходы к номенклатуре работ на каждом уровне единой лабораторной сети и преемственность в проведении исследований, а также внедрение стандартов ISO позволили не только сократить количество обязательно выполняемых тестов в лабораториях территориального уровня и исключить их дублирование, но и повысить качество исследований за счет подтверждения результатов в лабораториях регионального и федерального уровней.
Осуществлена интеграция эпидемиологической диагностики и лабораторного анализа, построенных на основе современных технологий, в едином алгоритме скрининга, мониторинга и контроля новых и возвращающихся инфекционных болезней. Для референс-центров и центров верификации диагностической деятельности на базе государственных коллекций патогенных микроорганизмов разработана система молекулярного типирования возбудителей особо опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы (чума, холера, сибирская язва, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз, особо опасные микозы, особо опасные фило-, арено-, ортопокси-, флави- и буньявирусы), в которой определен перечень методов, обладающих наибольшей разрешающей способностью для каждого патогена, а также уровень дискриминации, достигаемый с их использованием: отдельные генетические группы, подгруппы, субпопуляции и др., связанные с эколого-географической и таксономической характеристикой штаммов возбудителей [5-8].
Среди технологий молекулярного типирования возбудителей особо опасных инфекционных болезней нашли применение методы, основанные на анализе как всего генома патогена (пульс-гель электрофорез, рибопринтинг, RAPD), так и отдельных участков [мультилокусный анализ VNTR (MLVA), мультилокусное сиквенс-типирование (MLST), полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, выявление SNP и повторяющихся элементов] [5, 7-9, 12-18]. Заложенный в основу системы принцип использования для проведения анализа подходов с низкой и высокой разрешающей способностью позволяет повысить специфичность, информативность и воспроизводимость результатов молекулярного типирования патогенных биологических агентов.
Особое значение приобретает разработка и внедрение в практику тестов, позволяющих в максимально короткие сроки определять не только видовую принадлежность микроорганизма, но и дать ответ о его эпидемической значимости, фенотипических различиях, путях происхождения, структуре генома возбудителя. Этой цели отвечают мультипараметрические тест-системы, позволяющие одновременно выявлять 5-10 мишеней, а также чиповые технологии, которые увеличивают эти возможности в несколько десятков раз [19].
Существенной модернизации подверглись классические бактериологические методы анализа за счет автоматизации процесса идентификации микроорганизмов, а также определения их чувствительности к антибактериальным препаратам. Внедрение в широкую практику микробиологических лабораторий микрообъемных технологий, автоматизированных систем, экспертных баз данных имеет несомненные преимущества по сравнению с традиционными методами исследований. Это возможность одномоментной постановки широкого ряда биохимических тестов, идентификации большого количества (до 500 видов) различных групп микроорганизмов, сокращение продолжительности исследования и трудовых затрат, получение стандартных, воспроизводимых результатов [20].
Наряду с традиционными методами индикации и идентификации ПБА получили распространение физические и физико-химические методы анализа, базирующиеся на количественном измерении физических свойств веществ и характеризующиеся высокой автоматизацией, скоростью и простотой исследований. Одним из современных физико-химических методов анализа, позволяющим решить проблемы спектроскопических методов, является метод масс-спектрометрии, дающий возможность проводить качественный и количественный анализ состава вещества [21].
Расследование вспышек инфекционных болезней, в том числе неизвестной этиологии, с помощью методов типирования, невозможно без баз данных, содержащих последовательности полных или полиморфных фрагментов геномов возбудителей, их белковых профилей. Создание таких баз данных целесообразно проводить на базе Государственных коллекций высокопатогенных микроорганизмов, осуществляющих хранение и поддержание жизнеспособности штаммов возбудителей инфекционных болезней.
Особого внимания требовали вопросы обеспечения препаратами лабораторной диагностики особо опасных инфекций, поскольку именно их наличие обусловливает возможность проведения тех или иных исследований. В 2009 г. был проведен анализ, имеющихся на тот момент в арсенале противоэпидемических служб препаратов для выявления возбудителей особо опасных инфекций, который выявил ряд проблем в этой области [3].
С целью кардинального изменения данной ситуации был сформирован Сетевой график разработки и регистрации диагностических и профилактических препаратов, в реализации которого приняли участие все противочумные институты, ЦНИИЭ, ГНЦ ПМБ и ГНЦ ВБ "Вектор". В результате такого целевого планирования к 2014 г. удалось обеспечить зарегистрированными в установленном порядке препаратами лабораторную диагностику практически всех особо опасных инфекционных болезней, актуальных для Российской Федерации, а также требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории.
Необходимо отметить, что к 2014 г., когда эпидемия болезни, вызванной вирусом Эбола, приобрела масштаб ЧС в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение, в Российской Федерации уже была разработана и зарегистрирована ПЦР-тест-система для выявления вируса Эбола (ГНЦ ВБ "Вектор"). В настоящее время зарегистрирована и успешно используется на базе мобильного комплекса СПЭБ Роспотребнадзора, проводящего работу в Гвинейской Республике, еще одна ПЦР-тест-система для выявления вируса Эбола, производства Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора [22].
При разработке новых генодиагностических препаратов для детекции возбудителей особо опасных инфекционных болезней были использованы как традиционные подходы, основанные на использовании консервативных фрагментов генома патогенов, так и новые технологии анализа INDEL и SNP маркеров - участков, содержащих делеции/вставки и единичные полиморфные нуклеотиды [23-25]. Применение таких локусов в качестве ДНК-мишеней позволило создать наборы реагентов для определения методом ПЦР подвидов туляремийного микроба и видов бруцелл, в то время как идентификация этих таксономических единиц с помощью бактериологического анализа затруднительна. Внедрение новых методических приемов стало возможно за счет накопления новых данных о структуре генома возбудителей особо опасных инфекционных болезней, полученных при проведении фрагментного и полногеномного секвенирования последовательностей микроорганизмов, разработки способов стандартизации ПЦР-анализа (регистрация результатов в режиме реального времени, подготовка готовых к исследованию реакционных смесей и длительное их хранение в высушенном состоянии и др.).
В рамках профессиональной подготовки кадров и повышения квалификации был разработан комплекс программ, целью которых являлось совершенствование теоретических знаний по современным проблемам медицинской микробиологии, эпидемиологии, санитарной охраны территории РФ, обеспечению биобезопасности, а также совершенствование профессиональных навыков работы с возбудителями опасных инфекционных болезней, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) ме- роприятий, направленных на предотвращение и ликвидацию ЧС в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения, в том числе возникающих в результате биологических террористических актов.
Таким образом, внедрение в практику новых диагностических технологий, современных препаратов, стандартизация диагностических подходов, совершенствование нормативно-методической базы и высокий уровень профессиональной подготовки специалистов повысили качество и надежность лабораторной диагностики, осуществляемой в учреждениях, участвующих в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пудова Е.А., Чеканова Т.А., Маркелов М.Л., Дедков В.Г. и др. Разработка и апробация ДНК-чипа для индикации возбудителей особо опасных инфекций // Эпидемиология и инфекц. бол. Актуальные вопросы. 2014. № 3. С. 13-19.
2. Положение о порядке осуществления государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля) за лицами и транспортными средствами, пересекающими таможенную границу таможенного союза, подконтрольными товарами, перемещаемыми через таможенную границу таможенного союза и на таможенной территории таможенного союза (утверждены решением Комиссии таможенного союза от 28 мая 2010 г. № 299).
3. Онищенко Г.Г., Кузькин Б.П., Кутырев В.В., Щербакова С.А. и др. Актуальные направления совершенствования лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней // Пробл. особо опасных инфекций. 2009. № 1. С. 5-11.
4. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 88 от 17.03.2008 "О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней".
5. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И. и др. Стандартный алгоритм молекулярного типирования штаммов Yersinia pestis. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012; №3: 25-35.
6. Карань Л.С., Маленко Г.В., Бочкова Н.Г. и др. Применение молекулярно-генетических методов для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита // Бюллетень СО РАМН. 2007. № 4. С. 34-40.
7. Feil J.E., Li B.C., Aanensen D.M. et al. // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 1518-1530.
8. Popovic T., Bopp C., Olsvik O., Wachsmuth K. // J. Clin. Microbiol. 1993. Vol. 31. P. 2474-2482.
9. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Сучков И.Ю. и др. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae // Биотехнология. 2001. № 6. С. 85-88.
10. Danin-Poleg Y., Cohen L.A., Gancz H., Broza Y.Y. et al. Vibrio cholerae strain typing and phylogeny study based on simple sequence repeats// J. Clin. Microbiol. 2007. Vol. 45. P. 736-746.
11. Faruque S.M., Siddique A.K., Saha M.N. et al. Molecular characterization of a new ribotype of Vibrio cholerae O139 Bengal associated with an outbreak of cholera in Bangladesh// J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37. P. 1313-1318.
12. Godoy D., Randle G., Simpson A.J. et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei// J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41. P. 2068-2079.
13. Johansson A., Farlow J., Larsson P. et al. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiplelocus variable-number tandem repeat analysis// J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 5808-5818.
14. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 2928-2936.
15. Kenefic L.J., Beaudry J., Trim C. et al. A high resolution four-locus multiplex single nucleotide repeat (SNR) genotyping system in Bacillus anthracis // J. Microbiol. Methods. 2008. Vol. 73, N 3. P. 269-272.
16. Le Fleche P., Hauck Y., Onteniente L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis // BMC Microbiol. 2001. Vol. 1, N 1. P. 2.
17. Le Fleche P., Jacques I., Grayon M. et al. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay // BMC Microbiol. 2006. Vol. 6. P. 9.
18. Lista F., Faggioni G., Valjevac S. et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis// BMC Microbiol. 2006. Vol. 6. P. 33.
19. Санитарные правила СП 3.4.2318-08 "Санитарная охрана территории Российской Федерации".
20. O’Hara C.M. // Clin. Microbiol. Rev. 2005. Vol. 18. P. 147-162.
21. Спицын А.Н., Уткин Д.В., Куклев В.Е., Портенко С.А. и др. Применение MALDI масс-спектрометрии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: современное состояние и перспективы // Пробл. особо опасных инфекций. 2014. № 3. C. 77-82.
22. Дедков В.Г., Сафонова М.В., Боднев С.А., Кабанов А.С. и др. Совершенствование диагностической системы в формате ОТ-ПЦР в реальном времени "Амплисенс EBOV (ZAIRE)-FL" для детекции РНК вируса Эбола Заир // Пробл. особо опасных инфекций. 2015. Вып. 3. С. 55-57.
23. Абдрашитова А.С., Яцышина С.Б., Осина Н.А., Астахова Т.С. и др. "Разработка мультилокусных амплификационных тест-систем для выявления ускоренной идентификации эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов" // Биозащита и биобезопасность. 2014. Т. VI, № 2. С. 34-41.
24. Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А. Мультиплексная амплификационная тест-система для индентификации и дифференциации Bacillus Anthracis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2005.-N 3.-С.69-74
25. Осина Н.А., Сеничкина А.М., Бугоркова Т.В., Щербакова С.А. // Разработка амплификационных тест-систем для выявления возбудителя туляремии Пробл. особо опасных инфекций. 2015. Вып. 2.С. 54-57.