Еще одним вариантом долгосрочного хранения клеток микроорганизмов в жизнеспособном состоянии является их содержание при пониженных температурах в присутствии криозащитной среды в холодильных установках. Большинство бактерий способны сохраняться при температурах ниже -60 °С, поддерживая при этом высокую концентрацию живых клеток в течение длительного периода времени. Этот подход наиболее простой в исполнении по сравнению с остальными методами долгосрочной консервации микроорганизмов.
Реализация процесса низкотемпературного замораживания характеризуется минимальными объемами подготовительных работ, быстрыми исполнениями этапов консервации и извлечения хранимого материала. Замороженные образцы мало подвержены каким-либо генетическим изменениям и стабильно сохраняют свои первоначальные свойства.
Кроме того, некоторые культуры отличаются более высокими показателями жизнеспособности их клеток при данном способе консервации, чем при высушивании или лиофилизации. Наибольшая уязвимость метода низкотемпературной консервации заключается в необходимости обеспечения безотказной работы холодильных установок, а также в сложности транспортировки замороженного материала [7].
Один из вариантов низкотемпературной консервации является криоконсервация - метод, отличающийся хранением материала в жидком азоте. Этот подход предназначен для длительного сохранения биологического материала. При соблюдении температурных режимов, не допускающих размораживания объектов, титр живых клеток практически не изменяется, что позволяет хранить культуры микроорганизмов практически бесконечно. Наиболее надежный способ поддержания постоянной температуры хранящихся образцов - это непосредственное погружение их в жидкий азот, что гарантирует режим хранения при -196 °С. Однако данная процедура сопряжена с риском контаминации контейнеров и хранилища патогенными биологическими агентами из-за возможного попадания жидкого азота внутрь криопробирок [8-12]. Вследствие этого хранить вирулентные микроорганизмы рекомендуется в парах жидкого азота, не допуская соприкосновение контейнеров с жидкой фазой газа. При этом следует отметить отсутствие универсальных подходов к криоконсервации различных видов микроорганизмов, требующих использования различных криопротекторов и скорости замораживания клеточных суспензий. Вместе с тем в настоящее время разработаны протоколы криоконсервации для целого ряда видов микроорганизмов [23]. Несмотря на значительные преимущества описанного подхода, данный метод длительного хранения материала имеет ограниченное применение, поскольку для поддержания коллекционных фондов крупных коллекций потребуется организация автоматизированных криогенных хранилищ и выделение отдельного помещения для их размещения, также следует отметить более дорогой и трудоемкий процесс обмена образцами между коллекциями. Тем не менее криоконсервация удобна при поддержании микроорганизмов, плохо переносящих стрессовые условия других методов, и в настоящее время для ее реализации доступен широкий выбор криооборудования.
Таксономические исследования
Важнейшими задачами коллекционной деятельности являются определение таксономической принадлежности штаммов и установление их аутентичности заявленным паспортным данным. Изначально исследования в этом направлении строились на основе культурально-морфологических, фенотипических и серологических методов. Дальнейшие шаги в этом направлении были сделаны с развитием методик, направленных на изучение генома коллекционных штаммов.
Широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), с помощью которой проводится детекция основных генетических детерминант вирулентности, патогенности, а также различных видоспецифичных маркеров [14].
К настоящему времени разработано большое число молекулярно-генетических методов, направленных на типирование штаммов микроорганизмов и определение их таксономической принадлежности. Поскольку универсального подхода, безошибочно определявшего систематическое положение исследуемых культур, до сих пор не создано, необходимо использовать алгоритм их идентификации, основанный на 2-3 подходах, дополняющих друг друга. Так, устоявшимися подходами для типирования возбудителей чумы, холеры, туляремии, сибирской язвы, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза являются мультилокусное секвенирование (MLST - от англ. Multi Locus Sequence Typing), риботипирование, мультилокуснный VNTR анализ (MLVA - от англ. Multiple Loci VNTR Analysis) [15-24]. Для микроорганизмов, изучае- мых с помощью MLST и MLVA, созданы базы данных http://www.mlst.net/ и http://minisatellites.u-psud.fr/MLVAnet. Одним из методов создания геномных портретов возбудителя холеры является риботипирование. Этот подход, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, обладает хорошей воспроизводимостью, он зарекомендовал себя как способ дифференциации штаммов V. cholerae по их происхождению на различных эндемичных по холере территориях [25, 26]. Одним из примеров практического применения молекулярного типирования является расследование источника случаев почтового терроризма в США в 2001 г.
Изучение молекулярно-генетических свойств (в частности метод MLVA) используемого для этих целей штамма и сравнение полученных характеристик с соответствующими характеристиками набора коллекционных штаммов возбудителя сибирской язвы позволили установить название штамма, источник и автора рассылки сибиреязвенных спор [27].
Применение различных систем молекулярного типирования и создание на их базе алгоритмов по установлению аутентичности и систематического положения коллекционных штаммов прочно вошли в систему функционирования зарубежных коллекций. В коллекции ATCC с этой целью применяется комплекс методов, включающих как классический микробиологический скрининг, так и использование автоматизированных бактериологических анализаторов, массспектрометрию, а также секвенирование и рибопринтинг.
В Британской NCTC в основу идентификационного алгоритма положены изоферментный анализ, ДНК-фингерпринтинг и микросателлитное генотипирование, основанное на ПЦР.
Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) для установления аутентичности бактериальных штаммов использует секвенирование 16S рДНК, рибопринтинг, VNTR-анализ и ДНК-ДНК-гибридизацию. В Российской Федерации современные подходы к установлению систематического положения штаммов и их аутентичности реализуются в ряде коллекций немедицинского профиля: в частности во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) и во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). В последнее время такие подходы начинают применяться и в коллекциях, поддерживающих штаммы патогенных микроорганизмов [28].
Вместе с тем разработка единых алгоритмов определения таксономического положения и установления аутентичности коллекционных штаммов в настоящее время остается одним из приоритетных направлений деятельности Государственных коллекций патогенных микроорганизмов. В этой связи в рамках федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности (2015-2017 гг.)" запланированы и реализуются НИОКР, направленные на решение этих проблем.
Каталогизация коллекционных штаммов
К не менее значимым аспектам коллекционной деятельности относится каталогизация поддерживаемых штаммов.
Структурно такие каталоги коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов могут подразделяться на простые перечни, отражающие краткие сведения о микроорганизме, его происхождении, номера в различных коллекциях, условия культивирования и длительного хранения, а также банки данных аккумулирующие любые данные научных исследований, связанные с поддерживаемыми в коллекции культурами. Что касается каталогов первого типа, они создаются и пополняются по общепринятому принципу в обязательном порядке в любых крупных коллекциях. Из зарубежных коллекций следует отметить каталоги Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) и NCTC, расположенные в сети Интернет и находящиеся в открытом доступе [29, 30].
В Российской Федерации такие каталоги созданы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, причем часть из них представлена в формате XML (от англ. Extensible Markup Language). Подобные работы также велись в рамках государственной программы "Биоразнообразие" (1999-2001), результатом выполнения которой стало создание объединенного электронного каталога Российских коллекций немедицинского профиля. В его состав были включены сведения о штаммах, поддерживаемых во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН), а также еще 17 российских коллекций, в том числе и в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб". Окончательный вариант электронной версии Объединенного каталога (Consolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections.
CD version, release 1.0 (Fall 2002) был размещен в Интернете на веб-сайте ВКМ в формате электронной книги MS eReader в 5 томах на английском языке [31].
Безусловно, подобная форма каталогов удобна для ознакомления со структурой коллекционного фонда и подбора штаммов по их номеру, однако она не позволяет систематизировать микроорганизмы по их характеристикам. На актуальность этой проблемы в первую очередь указывает минимальный объем информации, представленный в литературе.
Известно, что подобные разработки велись в Институте микробиологии РАН. Созданная база данных UNIQEM (UNIQue and Extremophilic Microorganisms) позволяла накапливать и поддерживать списочную информацию о широком спектре микроорганизмов - каталожная база данных, а также осуществлять сбор, обработку и публикацию самой разнообразной информации по этим микроорганизмам и их характеристикам - база данных свойств. Созданный программный комплекс обладал возможностью хранения, обработки и опубликования информации о 1000 и более штаммов, характеризующихся не более чем по 1000 групп монофункциональных свойств, хранения связанной графической и текстовой информации, включающей состав сред, секвенсы, текстовые описания штаммов [32].
Деятельность в этом направлении проводилась и в коллекциях патогенных микроорганизмов. В рамках Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности (2009-2014 гг.)" в процессе реализации 6 НИОКР проведено совершенствование научно-методическое обеспечения паспортизации штаммов государственных и музейных коллекций патогенных бактерий и вирусов. В ходе выполнения этой работы в трех крупнейших государственных коллекциях патогенных микроорганизмов, функционирующих на базе учреждений Роспотребнадзора ФБУН ГНЦ ПМБ, ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" и ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб", разработаны структуры унифицированных электронных каталогов микроорганизмов I-II групп патогенности и их геномных портретов, определены методы генотипирования коллекционных штаммов, проведено полногеномное секвенирование их геномов.
В частности в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" создан электронный унифицированный каталог микроорганизмов I-II группы патогенности, включающий сведения о 1026 штаммах бактерий I-II группы патогенности. Кроме того, подготовлен унифицированный электронный каталог геномных портретов микроорганизмов I-II группы патогенности, пополненный сведениями о молекулярно-генетической организации 120 штаммов возбудителей чумы и холеры. Проведено полногеномное секвенирование 5 штаммов Y. pestis и V. cholera, а также подготовлены проекты нормативно-методических документов по проведению генотипирования штаммов патогенных микроорганизмов, правил их каталогизации и долгосрочного хранения.
Деятельность в рамках национальных центров верификации диагностической деятельности
Приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека "О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней" от 17.03.2008 № 88 регламентировано создание Национальных центров верификации диагностической деятельности и Национальных центров, осуществляющих функции государственных коллекций, на базе трех учреждений Роспотребнадзора: ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", ФБУН "ГНЦ ПМБ", ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" с возложением на них ряда функций:
■ верификация результатов диагностики опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы, проведенных центрами индикации и диагностики опасных инфекционных болезней Роспотребнадзора;
■ идентификация возбудителей опасных инфекционных болезней неустановленной этиологии с тяжелым клиническим течением (включая летальный исход), представленных центрами индикации и диагностики опасных инфекционных болезней Роспотребнадзора;
■ проведение молекулярно-эпидемиологических исследований и изучение вирусологических, бактериологических, молекулярно-биологических, серологических, иммунохимических свойств особо опасных патогенов;
■ хранение коллекционных штаммов и их депонирования.
Депонирование коллекционных штаммов
Уникальная функция государственных коллекций - обеспечение процедуры депонирования штаммов микроорганизмов, под которым обычно понимают процесс передачи штаммов в коллекцию для регистрации, хранения и выдачи их образцов. Цель этой процедуры - сохранение в признанных коллекциях (депозитариях) наиболее ценных штаммов, выделенных из природных источников или созданных путем генно-инженерных манипуляций, для обеспечения их доступности научному сообществу при соблюдении прав депозиторов. Выделяют 3 формы депонирования:
■ депонирование для открытого доступа или хранение (public deposit), отличающееся общедоступностью информации о поступившем штамме и возможностью его выдачи без соглашения депозитора;
■ сохранное депонирование или гарантированное хранение (safe deposit), направленное на сохранность штамма в коллекции с ограничением доступа к нему третьих лиц;
■ патентное депонирование (patent deposit), выполняемое с целью оформления патента на штамм микроорганизма, при этом различают международное и национальное патентное депонирование.
Депонирование для целей патентной процедуры считается осуществленным, если штамм, линия клеток или консорциум помещены в международный орган по депонированию, предусмотренный Будапештским договором о международном признании депонирования для целей патентной процедуры [33] или в уполномоченную на их депонирование российскую коллекцию, гарантирующую поддержание жизнеспособности объекта в течение по меньшей мере срока действия патента и удовлетворяющую другим установленным требованиям к коллекциям, осуществляющих депонирование для целей патентной процедуры [34]. Согласно последним данным, опубликованным Федеральным институтом промышленной собственности (ФИПС), в Российской Федерации к коллекциям, уполномоченным осуществлять депонирование патогенных для человека микроорганизмов, относятся Государственная коллекции патогенных микроорганизмов при ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб", ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" и ФБУН ГНЦ ПМБ [35].
Заключение
Таким образом, коллекционная деятельность, связанная с использованием штаммов патогенных микроорганизмов, - это направление научной деятельности по обеспечению биологической безопасности и санитарно-эпидемиологического благополучия населения РФ, которое успешно реализуется и гармонично развивается. Вместе с этим некоторые аспекты этой важной функции требуют дальнейшего совершенствования. В первую очередь это связано с разработкой и внедрением унифицированного подхода к принципам функционирования и реализации основных задач государственных коллекций патогенных микроорганизмов, закрепленным единым положением о коллекционной деятельности в области использования возбудителей I-II группы патогенности. Также необходимо обновить нормативно-методическую базу, регламентирующую правила депонирования штаммов патогенных микроорганизмов, выработав общий для всех коллекций документ. Не- маловажной задачей, стоящей перед государственными коллекциями, является создание единой унифицированной панели референтных штаммов патогенных микроорганизмов, необходимой для обеспечения научно-исследовательской, диагностической, производственной и учебной деятельности. Кроме того, необходимо непрерывно координировать процессы совершенствования методов молекулярного типирования возбудителей особо опасных инфекций, их консервации, хранения и информационного обеспечения, с учетом появления новых подходов, методик и технологий, поддерживая их на современном мировом уровне.
ЛИТЕРАТУРА
1. Porter J.R. The role of culture collections in the era molecular biology. ATCC 50th Anniversary Symposium, American Society for Microbiology. Washington, DC, 1976. P. 62-72.
2. Tsunematsu Y. Japanese Federation of Culture Collections. Proc. Int. Conference on Culture Collections. 1970. P. 79-83.
3. Озерская С.М., Кочкина Г.А., Иванушкина Н.Е., Запрометова К.М. и др. Состояние коллекций микроорганизмов в России // Вестн. биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2006. Т. 2, № 3. С. 51-61.
4. Маркин В.А. Коллекции патогенных вирусов в решении общебиологических проблем // Журн. микробиол. 2007. № 6. С. 84-93.
5. Seeliger H.P.R. The Medical Culture Collection // Impact of Science on Society. 1990. Vol. 158. P. 167-174.
6. Ashwood-Smith M.J. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology. Tunbridge, Wells: Pitman Medical, 1980. 323 p.
7. Gibson L. F., Khoury J.T. Storage and survival of bacteria by ultrafreeze // Lett. Appl. Microbiol. 1986. Vol. 3. P. 127-129.
8. Fountain D., Ralston M., Higgins N., Gorlin J.B. et al. Liquid nitrogen freezers: a potential source of microbial contamination of hematopoietic stem cell components // Transfusion. 1997. Vol. 37. P. 585-591.
9. Grout B.W.W., Morris G.J. Contaminated liquid nitrogen vapour as a risk factor in pathogen transfer // Theriogenology. 2009. Vol. 71. P. 1079-1082.
10. Hawkins A.E., Zuckerman M.A., Briggs M., Gilson R.J. et al. Hepatitis B nucleotide sequence analysis: Linking an outbreak of acute Hepatitis B to contamination of a cryopreservation tank // J. Virol. Methods. 1996. Vol. 60. P. 81-88.
11. Schafer T.W., Everett J., Silver G.H., Came P.E. Biohazard: Virus contaminated liquid nitrogen // Science. 1976. Vol. 191. P. 24-26.
12. Tedder R.S., Zuckerman M.A., Goldstone A.H., Hawkins A.E. et al. Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank //Lancet. 1995. Vol. 346. P. 137-140.
13. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms // Cryobiology. 2003. Vol. 46. P. 205-229.
14. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М. : Медицина, 2009. 470 с.
15. Achtman M., Morelli G., Zhu P., Wirth T. et al. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 17837-17842.
16. Farlow J., Smith K.L., Wong J., Abrams M. et al. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable-number tandem repeat analysis // J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 3186-3192.
17. Ghosh R., Nair G.B., Tang L., Morris J.G. et al. Epidemiological study of Vibrio cholerae using variable number of tandem repeats // FEMS Microbiol. Lett. 2008. Vol. 288. P. 196-201.
18. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A. et al. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70. P. 191-201.
19. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L. et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 2928-2936.
20. Kingston J.J., Tuteja U., Kapil M., Murali H.S. et al. Genotyping of Indian Yersinia pestis strains by MLVA and repetitive DNA sequence based PCRs // Antonie Van Leeuwenhoek. 2009. Vol. 96. P. 303-312.
21. Le Fleche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S. et al. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay // BMC Microbiol. 2006. Vol. 6. P. 1-14.
22. Mohapatra S.S., Ramachandran D., Mantri C.K., Colwell R.R. et al. Determination of relationships among non-toxigenic Vibrio cholerae O1 biotype El Tor strains from housekeeping gene sequences and ribotype patterns // Res. Microbiol. 2009. Vol. 160. P. 57-62.
23. Scholz H.C., Hubalek Z., Sedlacek I., Vergnaud G. et al. Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole Microtus arvalis // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. Vol. 58. P. 375-382.
24. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Bystrom M. et al. Evolution of subspecies of Francisella tularensis // J. Bacteriol. 2005. Vol. 187. P. 3903-3908.
25. Popovic T., Bopp C., Olsvik O., Wachsmuth K. Epidemiologic application of a standardized ribotype scheme for Vibrio cholerae O1 // J. Clin. Microbiol. 1993. Vol. 31. P. 2474-2482.
26. Vibrio cholerae: Genomics and Molecular Biology / eds S.M. Faruque, G.B. Nair Norfolk, UK : Caster Academic Press, 2008. 220 p.
27. Traeger M.S., Wiersma S.T., Rosenstein N.E., Malecki J.M. et al. First case of bioterrorism-related inhalational anthrax in the United States, Palm Beach County, Florida, 2001 // Emerg. Infect. Dis. 2002. Vol. 8. P. 1029-1034.
28. Червякова Н.С., Портенко С.А., Осин А.В. Номенклатурная ревизия штаммов рода Bacillus, хранящихся в ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" // Материалы юбил. Междунар. науч-практ. конф. Уральской противочумной станции 1914-2014 гг. Уральск, 2014. С. 197-199.
29. Каталог бактериальных штаммов Национальной коллекции типовых культур (NCTC). URL: http://www.phe-culturecollections.org.uk/products/bacteria/search.jsp (дата обращения: 10.11.2015)
30. Каталог микроорганизмов Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ). URL: https://www.dsmz.de/catalogues/catalogue-microorganisms.html (дата обращения: 10.11.2015)
31. Объединенный каталог Российских коллекций немедицинского профиля. URL: http://www.sevin.ru/collections/microcoll/consolidated.html (дата обращения: 10.11.2015).
32. Ахлынин Д.С., Гальченко В.Ф. Микробиологическая база данных UNIQEM: проблемы и перспективы // Микробиология. 2000. № 69. С. 574-580.
33. Будапештский договор о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Будапешт, 1977.
34. О правилах составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение : приказ Российского агентства по патентам и товарным знакам № 82 от 06.06.2003 // Рос. газ. 08.10.2003. № 202. С. 8.
35. Уткина Е.А., Гаврилова Е.Б. Депонирование микроорганизмов для целей национальной патентной процедуры // Патенты и лицензии. 2011. № 2. С. 34-39.