Среди факторов врожденного иммунитета в последние годы все большее внимание уделяется толлподобным рецепторам (toll-like receptors - TLR).
Универсальность механизмов, обусловленная как широким представительством данных маркеров на разнообразных клетках организма, так и широким спектром лигандов для них, определяет включение TLR в патогенетические звенья развития многих заболеваний. В настоящее время установлены различные нарушения в системе механизмов врожденного иммунитета, ассоциированных с TLR, в частности нарушения экспрессии TLR и распознавания лигандов, трансдукции сигналов, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR. Показано проявление этих нарушений при развитии атеросклероза, инфекционных, аутоиммунных, аллергических и некоторых других заболеваний [1, 2, 6, 7]. Так, отмечено, что дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекционным болезням.
Значимость этих механизмов для широкой клинической практики определяет необходимость внедрения адекватных и надежных методов оценки компонентов системы TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях клинической лаборатории лечебно-профилактических учреждений.
Целью работы являлось исследование экспрессии маркеров врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 на лимфоидных клетках пародонта (десневой жидкости) и пе- риферической крови методом иммунофлюоресцентной микроскопии у практически здоровых и больных хроническим пародонтитом.
Материал и методы
В исследовании принимали участие 150 пациентов - 88 (59 %) женщин и 62 (41 %) мужчины в возрасте от 18 до 73 лет с хроническим пародонтитом в фазе обострения (ХП) и 32 человека без признаков хронического воспаления пародонта (условно здоровые люди той же возрастной категории). Пациенты с ХП были разделены на 2 группы по пародонтологическим критериям, принятым в Российской Федерации: 1‑я группа - ХП средней степени тяжести, 2‑я группа - ХП тяжелой степени.
Пациенты последней группы имели рентгенологические признаки выраженного остеопороза челюстных костей.
Для выполнения поставленной задачи исследовали десневую жидкость у здоровых людей и экссудат пародонтального кармана больных ХП в фазе обострения с использованием стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Выделенные клетки окрашивали антителами к маркерам CD282 (соответствует рецептору TLR2) или СD284 (соответствует рецептору TLR4), меченными FITC, и фиксировали параформальдегидом. Готовые препараты просматривали под микроскопом ECLIPSE 50i (Nicon, Япония) при увеличении ×1000.
Для определения фенотипа лейкоцитов периферической крови использовали метод проточной лазерной цитофлуориметрии [3]. Для этого к 100 мкл крови добавляли по 10 мкл раствора антител, меченных флюоресцентными многоцветными красителями против TLR2 (TLR2 IgG1 - FITC), CD14 - PE, CD45 - PerCP, CD19 - APC, CD3 - AF700 или TLR4 (TLR4 IgG1 - FITC) и CD14 - PE, CD45 - PerCP, CD19 - APC, CD3 - AF700. В пробирки с негативным контролем добавляли мышиные антитела, меченные FITC (IgG1 - FITC), а также антитела, меченые PE, PerCP, APC и AlexaFluor 700. Инкубировали 30 мин в темноте при ±4 °С. Для удаления эритроцитов использовали лизирующий буфер FACSLyse (BDBioscience) в объеме 2,0 мл в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
Затем проводили центрифугирование при 500g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. К осажденным клеткам добавляли по 2,0 мл фосфатно-солевого буфера.
Клеточную взвесь дважды отмывали центрифугированием, после чего лейкоциты ресуспендировали и добавляли 0,5 мл фиксирующего буфера FACS CellFix (BD Bioscience).
Полученные пробы исследовали на проточном цитометре FACSCanto 2, определяя экспрессию TLR2 и TLR4 на основных субпопуляциях Т-лимфоцитов (CD3+-лимфоциты), В-лимфоцитов (CD19+-лимфоциты), моноцитах (CD14+моноциты) и гранулоцитах (CD45dim-нейтрофилы).
Вероятность различия исследуемых показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента t. Все расчеты проводили с помощью пакета программ Statistica 7.0.
Результаты и обсуждение
При проведении исследования с помощью иммунолюминесцентной микроскопии впервые в отечественной практике показано, что клетки десневой жидкости или экссудата пародонтального кармана, большую часть которых составляли лейкоциты, экспрессировали рецепторы врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 с различной интенсивностью.
По данным, полученным в контрольной группе, частота выявления клеток, экспрессирующих эти маркеры, составила 12,3±3,2 %, а в группе пациентов с ХП в фазе обострения - 4,1±2,1 % (p<0,05), т. е. оказалась статистически достоверно сниженной (в 3 раза).
Так, на рис. 1 в поле зрения люминесцентного микроскопа продемонстрированы 2 клетки, экспрессирующие CD282 (TLR2), меченные FITC. Видны ярко окрашенные скопления в виде гранул. На рис. 2 в фазовом контрасте видны 4 клетки, выделенные из экссудата пародонтального кармана. На рис. 3 при люминисцентном микроскопировании представлены эти же 4 клетки с неярким диффузным окрашиванием CD284‑FITC (TLR4). Таким образом, в результате данного пилотного исследования выявлена и визуализирована экспрессия рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 в десневой жидкости и экссудате пародонтального кармана при патологии пародонта (ХП).
&hide_Cookie=yes)
К сожалению, содержание клеточных элементов в десневой жидкости меньше, чем требуется для исследования иммунофенотипа клеток на проточном цитометре - 3,5-9,4×106 клеток в 1 мл [3]. При выделении клеток из десневой жидкости обычно используют ее смывы изотоническим раствором хлорида натрия, которые позволяют получить 5-10×103 клеток в 1 мл, т. е. примерно в 2 раза меньше, чем требуется.
Поэтому для получения дополнительных данных проводили исследования на клетках периферической крови.
В первой серии экспериментов определяли экспрессию TLR2 и TLR4 на лейкоцитах, выделенных из периферической крови пациентов (и условно здоровых людей) с помощью осаждения эритроцитов на 2 % желатине в фосфатно-солевом буфере, согласно стандартным методикам, применяемым для определения фенотипа иммунокомпетентных клеток [3].
Полученные данные, позволяют утверждать, что экспрессия TLR2 и TLR4 на лейкоцитах периферической крови у разных людей независимо от группы, к которой они принадлежали (больные ХП, условно здоровые), значительно варьировала от полного отсутствия до 100 % экспрессии на моноцитах крови некоторых людей. На рис. 4 и 5 представлены примеры определения маркеров CD14/CD282 и CD3/CD284 на нейтрофилах, лимфоцитах и моноцитах периферической крови.
&hide_Cookie=yes)
Оказалось, что экспрессия TLR2 на моноцитах (двойное окрашивание CD14/CD282) и TLR4 на лимфоцитах (двойное окрашивание CD3/CD284) была очень низкой и не превышала 1 %.
Во второй серии экспериментов клетки цельной крови одновременно окрашивали с помощью нескольких антител против определенных популяций лейкоцитов, меченых различными флюоресцентными метками. В данной модификации реакции иммунофенотипирования не теряли клетки никаких субпопуляций, что обычно происходит при выделении лейкомассы из периферической крови. Тем не менее доля клеток, экспрессирующих CD282 (TLR2), также была невысокой.
Оказалось, что выше всего уровень экспрессии маркеров CD282 (TLR2) наблюдали на лимфоцитах людей со здоровым пародонтом (1,06±0,45 %), т. е. на 56,24±24,12 млн кл/л (табл. 1). У пациентов 1‑й группы относительное и абсолютное содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD282, было в 3 раза ниже, чем у представителей контрольной группы (0,35±0,01 % и 18,82±0,93 млн кл/л). У пациентов 2‑й группы относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD282, было в 4 раза ниже, чем у представителей контрольной группы (0,26±0,05 %), а абсолютное - в 5,7 раза (9,91±1,91 млн кл/л).
&hide_Cookie=yes)
Экспрессия CD282 на моноцитах периферической крови у пациентов 2‑й группы (0,91±0,43 %, 43,72±5,34 млн кл/л) была в 1,4 раза выше, чем у людей в контрольной группе (0,65±0,11 %, 34,45±5,71 млн кл/л). Тем не менее, у пациентов 2‑й группы относительное количество моноцитов, экспрессирующих TLR2, было в 10 раз меньше, чем в контрольной группе, а абсолютное содержание - в 13,9 раза (2,48±1,12 млн кл/л). На нейтрофилах экспрессия CD282 была еще ниже. Так, у представителей контрольной группы эти рецепторы были определены на 0,34±0,04 % (18,15±2,16 млн кл/л) нейтрофилов. У пациентов 1‑й группы - относительное и абсолютное содержание было в 2,8 (0,12±0,01 %) и 3 раза (6,13±0,93 млн кл/л) меньше, а у больных 2‑й группы - в 4,3 (0,08±0,01 %) и 6,8 раза (2,67±3,05 млн кл/л) меньше, чем в контрольной группе.
Экспрессия CD284 (TLR4) на лейкоцитах периферической крови у обследованных пациентов имела такой же характер, хотя на лимфоцитах у пациентов 1‑й группы этих рецепторов было в 2,8 (0,73±0,13 %) и 2,9 раза (39,06±2,79 млн кл/л) больше, чем в контрольной группе (0,26±0,12 %, 13,52±6,50 млн кл/л). У представителей 2‑й группы относительное содержание CD284+лимфоцитов было выше, чем у людей со здоровым пародонтом, только в 1,2 раза (0,31±0,11 %), а абсолютное количество - в 1,14 раза ниже (11,81±4,19 млн кл/л).
На моноцитах самая высокая экспрессия CD284 была также у пациентов 1‑й группы с ХП средней степени тяжести: 2,17±0,18 % (117,02±3,8 млн кл/л) - в 15 раз больше, чем у пациентов контрольной группы (0,145±0,003 %, 7,63±1,51 млн кл/л). Самая низкая экспрессия - у пациентов 2‑й группы с ХП тяжелой степени и признаками остеопороза челюстных костей - относительное коли- чество (0,085±0,038 %) в 1,7 раза меньше, а абсолютное (3,39±2,67 млн кл/л) - в 2,3 раза меньше, чем у представителей контрольной группы (условно здоровых).
На нейтрофилах самая высокая экспрессия CD284 была в крови у людей контрольной группы (0,35±0,05 %, 18,25±3,11 млн кл/л); у пациентов 1‑й группы относительное количество (0,275±0,083 %) - в 1,3 раза, абсолютное (14,79±1,78 млн кл/л) - в 1,2 раза ниже, а у пациентов 2‑й группы относительное количество (0,21±0,07 %) - в 1,7 раза и абсолютное (8,05±2,67 млн кл/л) - в 2,3 раза ниже, чем у людей в контрольной группе (табл. 2).
Следует отметить, что у пациентов 1‑й группы относительное количество нейтрофилов, экспрессирующих TLR2, в 1,5 раза выше, чем у пациентов 2‑й группы, моноцитов - в 15 раз и лимфоцитов - в 1,3 раза выше. Разница в абсолютном содержании была еще больше, соответственно в 2,3, 17,6 и 1,9 раза.
Относительное количество нейтрофилов, экспрессирующих TLR4, у пациентов 1‑й группы в 1,3 раза выше, чем у пациентов 2‑й группы, моноцитов - в 25,5 раза и лимфоцитов - в 2,3 раза. Разница в абсолютном содержании также была выше, соответственно в 1,84, 34,5 и 3,3 раза.
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что основные популяции лейкоцитов периферической крови (нейтрофилы, моноциты и лимфоциты) экспрессируют на своей поверхности TLR2 и TLR4, выявляемые с помощью моноклональных антител к CD282 и CD284. У людей со здоровым пародонтом самая высокая экспрессия TLR2 наблюдается на лимфоцитах, в меньшей степени - на моноцитах и самая низкая - на нейтрофилах периферической крови. Наоборот, у здоровых людей больше всего было выявлено нейтрофилов с TLR4, в меньшем количестве - лимфоцитов и еще в меньшем - моноцитов.
У больных пародонтитом экспрессия TLR2 была выше на моноцитах, но ниже на нейтрофилах и лимфоцитах по сравнению с контролем; экспрессия TLR4 выше на моноцитах и лимфоцитах, но ниже на нейтрофилах. Экспрессия TLR2 на всех изучаемых популяциях лейкоцитов у пациентов с ХГП, ассоциированным с остеопорозом, была ниже, чем у здоровых людей в 4-14 раз и в 1,3-15 раза, чем у больных пародонтитом, ассоциированным с остеопенией. Экспрессия TLR4 у этих пациентов также была ниже в 1,2-2,3 раза, чем у здоровых людей и в 1,3-25,5 раза ниже, по сравнению с экспрессией Toll-подобных рецепторов на лейкоцитах больных пародонтитом, ассоциированным с остеопенией.
ВЫВОДЫ
1. Уровень экспрессии толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR4 принципиально не отличается на нестимулированных клетках периферической крови (нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах) и десневой жидкости у людей со здоровым пародонтом, но варьирует при развитии ХП.
2. У больных ХП средней и тяжелой степени в фазе обострения выявлена разнонаправленная экспрессия рецепторов TLR2 и TLR4 на клетках периферической крови как в сторону увеличения, так и уменьшения.
3. Достоверно более низкие показатели экспрессии маркеров TLR2 и TLR4 на клетках периферической крови наблюдали при ХП тяжелой степени, который сопровождался признаками остеопороза челюстных костей, что позволяет сделать предположение о том, что изменения в системе врожденного иммунитета, проявляющиеся на уровне экспрессии толл-подобных рецепторов, связаны с системной потерей минеральной плотности костной ткани и прогрессированием ХП.
Литература
1. Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Егорова Е.А. и др. Роль и биологическое значение Толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма // Вестн. РАМН. 2008. № 1. С. 45-54.
2. Бондаренко В.М., Гинцбург А.Л., Лиходед В.Г. Роль инфекционного фактора в патогенезе атеросклероза // Эпидемиология и инфекц. бол. 2011. № 1. С. 7-11.
3. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. М. :ГЭОТАР-Медиа, 2009. 345 c.
4. Burns E., Bachrach G., Shapira L., Nussbaum G. Cutting Edge: TLR2 is required for the innate response to Porphyromonasgingivalis: Activation leads to bacterial persistence and TLR2 deficiency attenuates induced alveolar bone resorption // J. Immunol. 2006. Vol. 177. P. 8296-8300.
5. Flemmig T.F., Beikler T. Control of oral biofilms // Periodontology 2000. 2011. Vol. 55, N 1. P. 9-15.
6. Koren O., Spor A., Felin J., Fak F. et al. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108, suppl 1. P. 4592-4598.
7. Krauss J.L., Potempa J., Lambris J.D., Hajishengallis G. Complementary Tolls in the periodontium: How periodontal bacteria modify complement and Toll-like receptor responses to prevail in the host // Periodontology 2000. 2010. Vol. 52. P. 141-162.