Противогерпесвирусная активность нанокапсулированных на основе аминооксида производных бигуанидина - инновационных биотехнологических медицинских препаратов с принципиально новым механизмом противоинфектогенного действия

• Львов Николай Дмитриевич
• Панюкова Елена Магомедсаидовна

Резюме

В работе представлены результаты исследования противогерпесвирусного эффекта инновационных биотехнологических медицинских препаратов с принципиально новым механизмом противоинфектогенного действия - нанокапсулированных на основе аминооксида производных бигуанидина. Изучали влияние препарата лиотропный жидкий кристалл хлоргексидина основания на репродукцию вируса простого герпеса 2 в эксперименте in vitro. Обнаружен достоверный ингибиторный эффект препарата: химиотерапевтический индекс составил 10,0.

Ключевые слова: вирус простого герпеса; инновационные биотехнологические нанокапсулированные препараты; изучение ингибиторного эффекта на чувствительных культурах клеток

Герпесвирусные инфекции человека - одна из ведущих социально значимых проблем здравоохранения. Статистический анализ последних лет выявляет прогрессивный рост заболеваемости герпесвирусами на земном шаре, опережающий темпы прироста населения. Клеточно-тканевый политропизм герпесвирусов и их способность вызывать развитие системной полиорганной соматопатологии, сопровождающейся прогрессирующим иммунодефицитом, обусловливают возможность как инвалидизации человека, так и летального исхода при тяжелых формах течения заболевания [1-3].

Известно, что по сравнению с достаточно большим разнообразием групп эффективных антибиотиков, применяемых для лечения бактериальных инфекций, количество противовирусных препаратов относительно невелико [2]. Поскольку вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, не имеющими собственного обмена веществ, энергетически они полностью зависимы от биохимических процессов внутриклеточного метаболизма. Это обстоятельство значительно затрудняет получение максимальной эффективности противовирусного соединения при минимальной или отсутствующей токсичности на клеточно-тканевом и организменном уровнях. В идеале противовирусный препарат не должен оказывать токсического действия в отношении здоровых клеток макроорганизма при максимальной клинической эффективности [3, 4].

Человечество располагает лишь двумя основными направлениями борьбы с вирусной инфекцией: химиотерапией и вакцинацией [5].

Арсенал лекарственных препаратов, обладающих противогерпесвирусной активностью, в соответствии с Международной анатомо-терапевтическо-химической (АТХ) классификацией лекарственных средств, входящих в группу JO5 противовирусных препаратов для системного применения, включает препараты, влияющие на вирус непосредственно. Группа препаратов JO5A подразделена на подгруппы:

· JO5AB "Нуклеозиды и нуклеотиды" - противогерпес­вирусные препараты первого и второго ряда - ацикловир (J05AB01), валацикловир (JO5AB11), фамцикловир (J05AB09), пенцикловир (JO5AB13), ганцикловир (J05AB06), валганцикловир (J05AB14), бривудин (J05AB15), цидофовир (JO5AB12);

· J05AD "Производные фосфоновой кислоты" - аналог пирофосфата фоскарнет (тринатриевая соль фосфономуравьиной кислоты, J05AD01);

· J05AC "Циклические амины" - тромантадин гидро­хлорид (J05AC03);

· J05AX "Прочие противовирусные препараты" - алпизарин (соединение ксантоновой природы отечественной разработки и производства - СССР, Россия).

· Кроме того, для лечения и профилактики герпесвирусных инфекций используется целый ряд препаратов, повышающих иммунофизиологическое противодействие герпесвирусам. К ним отнесены:

· L03AB - интерфероны и индукторы интерферонов;

· J06B - иммуноглобулины, иммуномодуляторы;

· АТХ - вакцины.

Несмотря на значительные достижения в разработке эффективных и достаточно безопасных противогерпесвирусных препаратов, инфекции, обусловленные герпесвирусами, остаются слабо контролируемыми. Это связано с рядом факторов:

· невозможностью непосредственного воздействия на вирус, способный интегрироваться с геномом клетки-хозяина [доказано, в частности, для герпесвируса человека 6‑го типа (HНV-6) и вируса Эпштейна-Барр [6]] или находящийся в виде плазмиды и локализирующийся в сенсорных ганглиях периферической нервной системы и в структурах ЦНС] [1];

· проблемой резистентности.

В результате многолетних интенсивных исследований соединений ряда ациклических нуклеозидных аналогов естественных метаболитов Гертруда Элайон (США) в 1974 г. синтезировала молекулу ациклогуанозина, а в 1988 г. она со своим коллективом была удостоена Нобелевской премии за разработку на основе этой формулы противогерпесвирусного препарата ацикловир [7].

В настоящее время ацикловир, а также его усовершенствованная форма валацикловир широко используются в мировой клинической практике.

Выраженная противовирусная эффективность, хорошая переносимость, отсутствие существенных побочных проявлений и осложнений, высокий коэффициент соотношения эффективности и токсичности при сравнительно низкой стоимости в аптечных сетях - факторы, обеспечившие столь высокий эксплуатационный успех ациклогуанозина и его производных на протяжении ряда десятилетий.

Однако препараты этого ряда (можно провести аналогию с антибиотиками пенициллиновой группы) часто используют без должного наблюдения со стороны специалистов. Несоблюдение режима применения препаратов, частая импульсная терапия, а также, напротив, длительная супрессивная терапия, длящаяся до полугода и более, может привести к развитию резистентности у вирусов герпеса к препаратам этой группы и, следовательно, к снижению их клинической эффективности [4].

Известно, что резистентность герпесвирусов к ациклогуанозину и его гомологам в 95% случаев обусловлена мутациями в гене тимидинкиназы (альфа-герпесвирусы) или протеинкиназы (цитоменаловирус) и в 5% случаев в гене ДНК-полимеразы - энзимов, с которыми связан механизм действия этих препаратов; относительно невысокой биодоступностью (Зовиракс - ацикловир 10-15%; Валтрекс, Валвир - до 30-50%; Фамвир - до 70- 77%), с учетом того, что герпесвирусы как нейротропные инфектогены способны легко пре­одолевать гематоэнцефалический барьер, применение этих препаратов не всегда оказывается эффективным у пациентов с серьезными неврологическими нарушениями герпесвирусного генеза [3, 4, 7].

Вышеизложенные причины обусловливают необходимость поиска соединений, обладающих противогерпес­вирусной активностью, с иным механизмом противовирусного действия, а также разрабатывать иные способы доставки инфектоцида в клетку, позволяющие повысить биодоступность лекарственного средства, т.е. создание новых генераций инновационных медицинских препаратов [3, 4, 7].

Цель исследования - изучение противогерпесвирусного эффекта нанокапcулированных на основе аминооксида производных бигуанидина - инновационных биотехнологических препаратов с принципиально отличающимся механизмом противоинфектогенного действия и принципиально новым механизмом доставки лекарственного средства в инфицированную клетку.

Материал и методы

Препараты. Использован препарат лиотропный жидкий кристалл хлоргексидина основания (ХО) - 1,1’-гексаметилен бис-[5-4-хлорфенил бигуанидин] в различных ассоциатах с аминоксидом в вариациях: окись алкилдиметиламина - амфолитного поверхностно-активного вещества, а также N-лаурил-N, N-диметиламинооксид; частично аммонийными соединениями, аминокислотами, алкиламином. ХО относят к классу бигуанидинов, он представляет собой хорошо растворимые ассоциаты с аминооксидом и другими компонентами, образующими жидкокристаллические структуры - нанокапсулы мицеллярного и ламеллярного типа.

Растворы стерилизовали путем фильтрации через мембранные фильтры типа Swinnex с диаметром 0,22 мкм. Готовили серийные 2- и 10-кратные разведения препаратов, используя питательную среду ИГЛА МЭМ ("ПанЭко", Россия).

Культура клеток. Для определения цитотоксичности и культивирования вирусов использовали монослойные перевиваемые клетки почек зеленой мартышки (клетки Vero), полученные из лаборатории культур тканей ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России. Клетки культивировали на питательной среде ИГЛА МЭМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, производство "ПанЭко", Россия), 2 мМ L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина. Посевная доза клеток составила 2×105 клеток/мл. Клетки рассевали в 48- и 24-луночные пластиковые планшеты (Corning, США) и инкубировали 24 ч при температуре +37,5 °С, 5% СО2 и 98% влажности до формирования полного монослоя.

Вирусы. В исследовании использовали тест-вирус, полученный из Государственной коллекции вирусов ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России: ВПГ-2 штамм "ВН". Вирус пассировали и титровали на монослойной культуре клеток Vero.

Инфекционные титры вируса определили при титровании в 24-луночных планшетах. Титрование вируса проводили по стандартной методике, используя метод конечных разведений от 10-1 до 10-6. Для титрования готовили возрастающие 10-кратные разведения вирусов, которые вносили по 0,1 мл в лунку с клетками, используя по 4 лунки на каждое разведение вируса, планшеты инкубировали при 37 °С в течение 2-3 дней до развития цитопатического действия вируса (ЦПД). Инфекционный титр вируса определяли по формуле в логарифмических единицах (lg ТЦИД50/мл) по методу Рида и Менча [8].

Максимальные титры ВПГ-2 составляли 4,5-5,0 lg ТЦИД50/мл. Аликвоты высокоактивной культуральной вирус-содержащей жидкости (ВСЖ) по 1 и 5 мл сохраняли до проведения опытов при -70 °С.

Оценку активности исследуемых препаратов осуществляли по стандартной методике в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [7].

Цитотоксическое действие препаратов для культуры клеток Vero оценивали по морфологии и жизнеспособности клеток. Для этого в предварительно освобожденные от ростовой среды лунки со сформировавшимся монослоем клеток Vero, трижды отмытым теплым раствором Хэнкса, вносили различные концентрации препаратов в диапазоне концентраций от 10-1 до 10-6, инкубировали в тех же условиях, что и при культивировании (2 мл). Учет результатов проводили через 24, 48, 72 ч визуально методом световой микроскопии с помощью инвертированного микроскопа по появлению цитодеструктивных изменений и изменению морфологии клеточного монослоя, а также по снижению темпов роста клеточной культуры:

· подсчитывали концентрацию клеток - применяли окрашивание клеток 0,4% раствором трипанового синего (trypan blue exclusion method, краситель окрашивает только мертвые клетки);

· изучали пролиферативную активность клеток при добавлении препарата путем определения индекса пролиферации, вычисляемого как отношение числа выросших клеток к числу засеянных - окрашивание 0,1% раствора кристалл-виолета;

· определяли уменьшение процента жизнеспособных клеток (жизнеспособность клеток оценивали по количеству неокрашенных клеток в процентах общего их числа).

Количественно цитотоксичность выражали как:

· ТЦД50/мл [тканевую цитотоксическую концентрацию препарата, которая вызывала гибель 50% клеток в популяции (ТЦД50)];

· максимально переносимую концентрацию препарата (МПК) - наиболее высокую концентрацию, которая не вызывала видимых цитодеструктивных изменений клеточного монослоя.

Для дальнейших исследований использовали препараты в концентрациях, не превышающих МПК.

Противовирусная активность препаратов оценена по степени ингибирования ЦПД вирусов, по влиянию на репродукцию вирусов. Эксперименты проводили в 24- и 48-луночных культуральных планшетах, в тех условиях культивирования, что и при исследовании цитотоксичности (см. раздел "Культура клеток").

Оценку противовирусного действия препарата в культуре клеток проводили в соответствии с методом ингибирования развития вирус-индуцированного ЦПД [cytopathic effect (CPE) reduction assay], а также с помощью метода снижения инфекционного титра вируса под воздействием препарата (lg). Для этого клетки культивировали в планшетах, как было описано ранее, затем ростовую среду удаляли, клетки трижды отмывали теплым раствором Хэнкса и заражали тест-вирусом в дозе, обеспечивающей множественность инфицирования - 100 ТЦД50/мл (оценка противовирусной активности) или 10-кратными разведениями вируса от 10-1 до 10-8 (титрование ВСЖ).

Инокуляцию вирусом клеточного монослоя осуществляли:

· за 1 или 2 ч до препарата "лечебная схема" - оптимальная схема для выявления противовирусной активности большинства противовирусных агентов при проведении скрининга;

· внесение вируса одновременно с препаратом ("лечебно-профилактическая схема").

Далее планшеты инкубировали в стандартных условиях. В качестве позитивного контроля использовали инфицированные тест-вирусом культуры клеток, к которым добавляли поддерживающую среду без препаратов, негативным контролем служили неинфицированные клетки, к которым добавляли поддерживающую среду без препаратов; в качестве негативного контроля цитотоксичности - неинфицированные культуры клеток, инкубируемые в присутствии различных концентраций препарата в составе среды поддержки. Результаты учитывали ежедневно в течение 96 ч, визуально оценивая целостность монослоя и характер вирус-специфического ЦПД в опытных и контрольных культурах клеток методом световой микроскопии по общепринятому способу. Результаты учитывали при появлении выраженного (100%) ЦПД вируса в контрольных пробах ("позитивный контроль").

Для оценки селективности противовирусного действия вычисляли химиотерапевтический индекс (ХТИ):

где ТЦД50 - тканевая цитотоксическая доза, вызывающая морфологические изменения ткани и снижающая жизнеспособность клеточной культуры на 50%; ТЦИД50 (ИД50) - тканевая цитотоксическая доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50%.

Если препарат имеет ХТИ <1, это практически неактивное вещество в отношении вируса. Если ХТИ >8 - препарат обладает селективным эффектом.

Бактерии и грибы. Культивирование бактериальных микроорганизмов и грибов (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerоginosa, Klebsiella pneumoniае, Candida albicans) проводили на плотных питательных средах в течение 168 ч. Оценивали минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) через 24 ч и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) через 72 ч. Исследования выполнены согласно МУК 4.2.1890-04 от 04.03.2014 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам". Для культивирования микроорганизмов использовали следующие питательные среды - агар и бульон ГРМ № 1 (ТУ 9398-001-7895326-2006) для выращивания бактерий и ГРМ № 2 (Сабуро) - ТУ 9398-002-78095326-2006 для выращивания грибов (производство ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия).

Антибактериальную активность определяли:

· методом серийных разведений в бульоне, для этого готовили 10-кратные разведения препаратов (от 0,25 до 0,000025%) в пробирках, содержащих 4 мл питательного бульона. Пробирки заражали по 0,02 мл бактериальной культурой микроорганизмов в концентрации 107 КОЕ/мл по стандарту мутности бактериальных взвесей [ОСО 42-28-2019(10МЕ)]. Далее инкубировали при температуре 37 °С. Наличие бактериального роста учитывали визуально по мутности в пробирках. За МИК принимали минимальную концентрацию препарата, при которой рост отсутствовал через 24 ч инкубации, за МБК - через 72 ч;

· методом серийных разведений на агаре (микрокаплями) - на поверхность питательного агара, содержащего 10-кратные серийные разведения препаратов (от 0,25 до 0,000025%), наносили по 10 мкл бакте­риальной суспензии в концентрации 107 КОЕ/мл и оставляли до полного впитывания капель. Далее инкубировали при температуре 37 °С. Результаты учитывали по наличию роста бактерий в местах нанесения капли через 24 ч (МПК) и 72 ч для МБК.

Статистический анализ выполнен с использованием пакета программного обеспечения Statistica StatSoft 10.0. Представлены результаты 3 независимых экспериментов. Статистический анализ результатов выполняли по общепринятым для биологических исследований методам. Вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего арифметического (m). Достоверность различий между показателями определяли с использованием критерия Стьюдента, различия считали достоверными при р<0,05, высокодостоверными - при р<0,001, недостоверными при р>0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования необходимо было определить цитотоксичность, т.е. определить возможность использования препаратов без повреждающего действия на клетки - ТЦД50 и МПК.

В исследование были взяты концентрации растворов хлоргексидина: 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625; 0,00313; 0,00157 и 0,00125% (см. таблицу). Установлено, что разведения ХO в концентрациях от 0,2 до 0,025% вызывали видимые деструктивные изменения клеток монослоя, т.е. оказывали выраженное цитопатическое действие, что отражалось на 1-е сутки наблюдения статистически достоверным (р<0,018) снижением как плотности клеточного монослоя, так и жизнеспособности клеток. В концентрации 0,0125% цитотоксичность составила 50% на 1-е сутки (снижение темпов роста культуры и процента жизнеспособных клеток на 54%) и 75% на 2-е сутки. При концентрации 0,00625% отмечена 25% цитотоксичность на 1-е сутки и 50% - на 2-е. В концентрациях 0,00313 и 0,00157% препараты не оказывали токсического влияния на физиологическое состояние клеток в течение всего периода наблюдения, показатели на уровне контрольных: 50% тканевая цитотоксическая доза ТЦД50/мл составила 0,0125%, она же - МПК. Для дальнейших экспериментов использовали концентрации, не превышающие МПК (0,0125-0,00125%), так как более высокие концентрации (0,2-0,025%) использовать нецелесообразно, поскольку они оказывали выраженный цитотоксический эффект.

Исследование противовирусного действия препаратов на репродукцию вируса простого герпеса in vitro в культуре клеток Vero

С целью изучения влияния препаратов на ВПГ в культуре клеток инфицировали клетки вирус-содержащей суспензией в концентрации 100 ТЦИД50/мл и в диапазоне разведений ВСЖ с кратностью 10 (в раститровке); которую вносили на клеточный монослой 1 ч ("лечебная схема") до внесения препарата и одновременно с препаратом. Результаты исследования оценивали под микроскопом:

- при развитии 100% характерного ЦПД вируса в конт­роле по способности предотвращать развитие вирус-индуцированного ЦПД и количественно выражали как lg ТЦИД50/мл и lg ТЦИД100/мл (концентрации, ингибирующие развитие ЦПД вируса на 50% и практически полностью);

- по снижению инфекционного титра вируса в lg ТЦИД50/мл по сравнению с контролем.

В первом случае используемые концентрации препарата от 0,0125 до 0,00125% были ниже, чем величина их ТЦИД50/мл - тканевая цитотоксическая доза, вызывающая гибель 50% клеток, определяемая с использованием метода окрашивания клеток трипановым синим.

Было установлено, что при использовании концентрации 0,0125% в МПК (внесение препарата через 1 ч после инфицирования) отмечается ингибиторное действие на ВПГ-2 (разведение вируса 1 : 100) на 100% (ТЦИД100) в 1‑е сутки наблюдения; снижение титра вируса составило 5-5,5 lg ТЦИД50/мл, но при этом отмечено цитотоксическое действие препарата на клетки. В концентрациях 0,00625; 0,00313; 0,00157 и 0,00125% также наблюдали противовирусное действие препарата, снижение титра вируса на 5,0-5,5 lg ТЦИД50/мл. Концентрация препарата 0,00125% обеспечивала эффект, соответствующий ТЦИД50 (ИД50).

При одновременном внесении препарата и вируса отмечено выраженное противовирусное действие ХО во всех концентрациях в 1-е сутки наблюдения.

Как известно, критерием оценки эффективности препарата in vitro является его способность ингибировать репродукцию вируса, что выражается снижением титра вируса при действии вещества. Если в присутствии соединения в МПК титр снижается не менее чем на 1,25-2,0 lg, то соединение проявляет минимальную противовирусную активность. ХТИ ≥8 указывает на достоверное селективное противовирусное действие препарата в различных концентрациях. По результатам проведенных исследований наибольшее противовирусное действие в отношении ВПГ-2 было выявлено в концентрации 0,00125%, при которой отмечали выраженный ингибиторный эффект; ХТИ составил 10,0.

При исследовании активности ХО против бактерий и грибов установлено, что препарат в концентрации 0,025% обладал антибактериальной активностью в отношении всех использованных тест-штаммов микроорганизмов. Для S. aureus и E. coli МБК составила 0,00025% как на питательном агаре, так и в бульоне, для P. aeruginosa 0,025%, а для C. albicans 0,013%. Воздействие препарата ХО на культуру бактерий в МБК, которая составила 0,0025-0,03% при экспозиции 30 и 60 мин, привело к 100% гибели микроорганизмов.

В результате проведенных экспериментов in vitro было установлено, что нанокапсулированный на основе аминооксида препарат производных бигуанидина обладает противовирусной активностью при использовании по лечебной схеме (через 1 ч после заражения вирусом), т.е. во время раннего этапа репродукции вируса.

ХО нерастворим в воде и поэтому до сих пор не применялся. Для улучшения его растворимости или диспергирования в водных средах разработана нанотехнология, позволяющая смоделировать на молекулярном уровне специфические "капсулы" размером менее 100 нм, содержащие молекулярные олигомерные частицы ХО. Разработанный нанобиотехнологический подход позволяет получать растворимые композиции "жидкокристаллической фазы", представляющие своего рода матрицу для капсулирования молекул олигомеров с определенными функциональными химическими группами или низкомолекулярных ингибиторов, имеющих низкую растворимость либо низкую биодоступность, обеспечивая тем самым оптимизацию их фармакокинетических свойств. Уничтожение инфектогена, по сути, происходит на управляемом уровне надмолекулярных структур [9].

Метод и механизм солюбилизации (коллоидального растворения) хлоргексидинового основания, т.е. использование его не в виде солей (биацитата, биглюконата, дигидрохлорида), а напрямую, усиливает его эффективность более чем в 100 раз [9] и является научным прорывом в возможности создания нового поколения медицинских препаратов.

Продукты, получаемые на основе подобной технологии, будут эффективны против всех типов микроорганизмов - бактерий, грибов, простейших, вирусов, архей, их резистентных штаммов и форм - спор, L-форм, а также микроорганизмов внутри биопленок, где их устойчивость может быть в 100-1000 раз выше, чем у так называемых планктонных форм [9].

Данный технологический метод позволяет снизить токсичность препарата для клеток эукариотов макроорганизма вследствие его локации внутри нанокапсул аминооксида благодаря улучшению фармакокинетических параметров действующего соединения, обеспечения защиты активной субстанции от агрессивного воздействия внутренней окружающей среды человеческого организма, а также последующее безопасное удаление естественным путем. Все вышеизложенное доказывает перспективность подобного подхода.

Создан абсолютно новый принцип, позволяющий капсулировать любые антивирусные и противобактериальные вещества. Капсулы, жидкокристаллические мицеллы из олигомеров стабильны, поскольку экранированы нейтральным зарядом, что позволяет молекуле активно действующего вещества сохранять антиинфектогенную активность и воздействовать непосредственно на мишень - возбудитель инфекционной болезни [10, 11].

Существующие в настоящее время в мировой практике способы капсулирования действующих веществ основаны на липосомальной технологии или использовании наноматериалов (фуллеренов и др.) [10].

Заключение

На примере вышеизложенных результатов проведенной работы доказан выраженный противовирусный и бактерицидный эффект нанокапсулированных на основе аминооксида соединений ХО, что свидетельствует о перспективности разработки и использования их, а также метода капсулирования как способа доставки лекарственных веществ внутрь клетки эукариотов для профилактики и терапии широкой палитры инфекционных заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

1. Farkas E., Kiss D., Zelkó R. Study on the release of chlorhexidine base and salts from different liquid crystalline structures // Int. J. Pharm. 2007. Vol. 340, N 1-2. P. 71-75. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.03.038 PMID: 17467206.

2. Львов Н.Д., Панюкова Е.М., Никитина А.А. Современные методы экспресс-диагностики герпесвирусной инфекции различной локализации. Клинико-вирусологические параллели // Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности Российской Федерации : учебно-методическое пособие для факультетов последипломного образования по специальностям: вирусология, инфекционные болезни, иммунология и эпидемиология. Москва : Изд-во Первого МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России, 2014. С. 129-137.

3. Львов Н.Д. Герпесвирусы - недооцененная угроза человечеству // Сборник VII Научно-практической конференции с международным участием "Здоровье иммунной системы. Иммунотропная инфекция. Новые опухолевые маркеры". Москва : ФГБУ Поликлиника № 1 УДП РФ, 16 марта 2018. С. 49-58.

4. Львов Н.Д. Герпесвирусы человека - системная интегративная иммуно­патология // РМЖ. 2012. № 22. С. 1133-1137.

5. Ершов Д.И., Романцов М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях : руководство для врачей. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2007.

6. Samad A., Sultana Y., Aqil M. Liposomal drug delivery systems: an update review // Curr. Drug Deliv. 2007. Vol. 4, N 4. P. 297-305.

7. Львов Н.Д. Герпесвирусные инфекции - общая характеристика. Монография. Глава 2.3.3.1. Вирусные инфекции кожи и слизистых оболочек. // Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / под ред. Д.К. Львова. Москва : Медицинское информационное агентство, 2013. С. 599-603.

8. De Bolle L., Naesens L., De Clercq E. Update on human herpesvirus 6 biology, clinical features, and therapy // Clin. Microbiol. Rev. 2005. Vol. 18, N 1. P. 217-245. DOI: https://doi.org/10.1128/CMR.18.1.217-245.2005 PMID: 15653828; PMCID: PMC544175.

9. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. I. Москва : Гриф и К, 2012. 944 с.

10. Ноздрачев А.Д., Марьянович А.Т., Поляков Е.Л., Сибаров А.Д., Хавинсон В.Х. Нобелевские премии по физиологии и медицине за 100 лет. Санкт-Петербург : Гуманистика, 2002. 688 с.

11. Павлова И.Б., Кононенко А.Б., Толмачева Г.С., Рыцарев А.Ю. Формирование биопленок патогенными бактериями и воздействие на них нового дезинфицирующего препарата // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2018. № 4. С. 56-62.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)