Оценку противовирусного действия препарата в культуре клеток проводили в соответствии с методом ингибирования развития вирус-индуцированного ЦПД [cytopathic effect (CPE) reduction assay], а также с помощью метода снижения инфекционного титра вируса под воздействием препарата (lg). Для этого клетки культивировали в планшетах, как было описано ранее, затем ростовую среду удаляли, клетки трижды отмывали теплым раствором Хэнкса и заражали тест-вирусом в дозе, обеспечивающей множественность инфицирования - 100 ТЦД50/мл (оценка противовирусной активности) или 10-кратными разведениями вируса от 10-1 до 10-8 (титрование ВСЖ).
Инокуляцию вирусом клеточного монослоя осуществляли:
· за 1 или 2 ч до препарата "лечебная схема" - оптимальная схема для выявления противовирусной активности большинства противовирусных агентов при проведении скрининга;
· внесение вируса одновременно с препаратом ("лечебно-профилактическая схема").
Далее планшеты инкубировали в стандартных условиях. В качестве позитивного контроля использовали инфицированные тест-вирусом культуры клеток, к которым добавляли поддерживающую среду без препаратов, негативным контролем служили неинфицированные клетки, к которым добавляли поддерживающую среду без препаратов; в качестве негативного контроля цитотоксичности - неинфицированные культуры клеток, инкубируемые в присутствии различных концентраций препарата в составе среды поддержки. Результаты учитывали ежедневно в течение 96 ч, визуально оценивая целостность монослоя и характер вирус-специфического ЦПД в опытных и контрольных культурах клеток методом световой микроскопии по общепринятому способу. Результаты учитывали при появлении выраженного (100%) ЦПД вируса в контрольных пробах ("позитивный контроль").
Для оценки селективности противовирусного действия вычисляли химиотерапевтический индекс (ХТИ):
где ТЦД50 - тканевая цитотоксическая доза, вызывающая морфологические изменения ткани и снижающая жизнеспособность клеточной культуры на 50%; ТЦИД50 (ИД50) - тканевая цитотоксическая доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50%.
Если препарат имеет ХТИ <1, это практически неактивное вещество в отношении вируса. Если ХТИ >8 - препарат обладает селективным эффектом.
Бактерии и грибы. Культивирование бактериальных микроорганизмов и грибов (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerоginosa, Klebsiella pneumoniае, Candida albicans) проводили на плотных питательных средах в течение 168 ч. Оценивали минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) через 24 ч и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) через 72 ч. Исследования выполнены согласно МУК 4.2.1890-04 от 04.03.2014 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам". Для культивирования микроорганизмов использовали следующие питательные среды - агар и бульон ГРМ № 1 (ТУ 9398-001-7895326-2006) для выращивания бактерий и ГРМ № 2 (Сабуро) - ТУ 9398-002-78095326-2006 для выращивания грибов (производство ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия).
Антибактериальную активность определяли:
· методом серийных разведений в бульоне, для этого готовили 10-кратные разведения препаратов (от 0,25 до 0,000025%) в пробирках, содержащих 4 мл питательного бульона. Пробирки заражали по 0,02 мл бактериальной культурой микроорганизмов в концентрации 107 КОЕ/мл по стандарту мутности бактериальных взвесей [ОСО 42-28-2019(10МЕ)]. Далее инкубировали при температуре 37 °С. Наличие бактериального роста учитывали визуально по мутности в пробирках. За МИК принимали минимальную концентрацию препарата, при которой рост отсутствовал через 24 ч инкубации, за МБК - через 72 ч;
· методом серийных разведений на агаре (микрокаплями) - на поверхность питательного агара, содержащего 10-кратные серийные разведения препаратов (от 0,25 до 0,000025%), наносили по 10 мкл бактериальной суспензии в концентрации 107 КОЕ/мл и оставляли до полного впитывания капель. Далее инкубировали при температуре 37 °С. Результаты учитывали по наличию роста бактерий в местах нанесения капли через 24 ч (МПК) и 72 ч для МБК.
Статистический анализ выполнен с использованием пакета программного обеспечения Statistica StatSoft 10.0. Представлены результаты 3 независимых экспериментов. Статистический анализ результатов выполняли по общепринятым для биологических исследований методам. Вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего арифметического (m). Достоверность различий между показателями определяли с использованием критерия Стьюдента, различия считали достоверными при р<0,05, высокодостоверными - при р<0,001, недостоверными при р>0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования необходимо было определить цитотоксичность, т.е. определить возможность использования препаратов без повреждающего действия на клетки - ТЦД50 и МПК.
В исследование были взяты концентрации растворов хлоргексидина: 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625; 0,00313; 0,00157 и 0,00125% (см. таблицу). Установлено, что разведения ХO в концентрациях от 0,2 до 0,025% вызывали видимые деструктивные изменения клеток монослоя, т.е. оказывали выраженное цитопатическое действие, что отражалось на 1-е сутки наблюдения статистически достоверным (р<0,018) снижением как плотности клеточного монослоя, так и жизнеспособности клеток. В концентрации 0,0125% цитотоксичность составила 50% на 1-е сутки (снижение темпов роста культуры и процента жизнеспособных клеток на 54%) и 75% на 2-е сутки. При концентрации 0,00625% отмечена 25% цитотоксичность на 1-е сутки и 50% - на 2-е. В концентрациях 0,00313 и 0,00157% препараты не оказывали токсического влияния на физиологическое состояние клеток в течение всего периода наблюдения, показатели на уровне контрольных: 50% тканевая цитотоксическая доза ТЦД50/мл составила 0,0125%, она же - МПК. Для дальнейших экспериментов использовали концентрации, не превышающие МПК (0,0125-0,00125%), так как более высокие концентрации (0,2-0,025%) использовать нецелесообразно, поскольку они оказывали выраженный цитотоксический эффект.
Исследование противовирусного действия препаратов на репродукцию вируса простого герпеса in vitro в культуре клеток Vero
С целью изучения влияния препаратов на ВПГ в культуре клеток инфицировали клетки вирус-содержащей суспензией в концентрации 100 ТЦИД50/мл и в диапазоне разведений ВСЖ с кратностью 10 (в раститровке); которую вносили на клеточный монослой 1 ч ("лечебная схема") до внесения препарата и одновременно с препаратом. Результаты исследования оценивали под микроскопом:
- при развитии 100% характерного ЦПД вируса в контроле по способности предотвращать развитие вирус-индуцированного ЦПД и количественно выражали как lg ТЦИД50/мл и lg ТЦИД100/мл (концентрации, ингибирующие развитие ЦПД вируса на 50% и практически полностью);
- по снижению инфекционного титра вируса в lg ТЦИД50/мл по сравнению с контролем.
В первом случае используемые концентрации препарата от 0,0125 до 0,00125% были ниже, чем величина их ТЦИД50/мл - тканевая цитотоксическая доза, вызывающая гибель 50% клеток, определяемая с использованием метода окрашивания клеток трипановым синим.
Было установлено, что при использовании концентрации 0,0125% в МПК (внесение препарата через 1 ч после инфицирования) отмечается ингибиторное действие на ВПГ-2 (разведение вируса 1 : 100) на 100% (ТЦИД100) в 1‑е сутки наблюдения; снижение титра вируса составило 5-5,5 lg ТЦИД50/мл, но при этом отмечено цитотоксическое действие препарата на клетки. В концентрациях 0,00625; 0,00313; 0,00157 и 0,00125% также наблюдали противовирусное действие препарата, снижение титра вируса на 5,0-5,5 lg ТЦИД50/мл. Концентрация препарата 0,00125% обеспечивала эффект, соответствующий ТЦИД50 (ИД50).
При одновременном внесении препарата и вируса отмечено выраженное противовирусное действие ХО во всех концентрациях в 1-е сутки наблюдения.
Как известно, критерием оценки эффективности препарата in vitro является его способность ингибировать репродукцию вируса, что выражается снижением титра вируса при действии вещества. Если в присутствии соединения в МПК титр снижается не менее чем на 1,25-2,0 lg, то соединение проявляет минимальную противовирусную активность. ХТИ ≥8 указывает на достоверное селективное противовирусное действие препарата в различных концентрациях. По результатам проведенных исследований наибольшее противовирусное действие в отношении ВПГ-2 было выявлено в концентрации 0,00125%, при которой отмечали выраженный ингибиторный эффект; ХТИ составил 10,0.
При исследовании активности ХО против бактерий и грибов установлено, что препарат в концентрации 0,025% обладал антибактериальной активностью в отношении всех использованных тест-штаммов микроорганизмов. Для S. aureus и E. coli МБК составила 0,00025% как на питательном агаре, так и в бульоне, для P. aeruginosa 0,025%, а для C. albicans 0,013%. Воздействие препарата ХО на культуру бактерий в МБК, которая составила 0,0025-0,03% при экспозиции 30 и 60 мин, привело к 100% гибели микроорганизмов.
В результате проведенных экспериментов in vitro было установлено, что нанокапсулированный на основе аминооксида препарат производных бигуанидина обладает противовирусной активностью при использовании по лечебной схеме (через 1 ч после заражения вирусом), т.е. во время раннего этапа репродукции вируса.
ХО нерастворим в воде и поэтому до сих пор не применялся. Для улучшения его растворимости или диспергирования в водных средах разработана нанотехнология, позволяющая смоделировать на молекулярном уровне специфические "капсулы" размером менее 100 нм, содержащие молекулярные олигомерные частицы ХО. Разработанный нанобиотехнологический подход позволяет получать растворимые композиции "жидкокристаллической фазы", представляющие своего рода матрицу для капсулирования молекул олигомеров с определенными функциональными химическими группами или низкомолекулярных ингибиторов, имеющих низкую растворимость либо низкую биодоступность, обеспечивая тем самым оптимизацию их фармакокинетических свойств. Уничтожение инфектогена, по сути, происходит на управляемом уровне надмолекулярных структур [9].
Метод и механизм солюбилизации (коллоидального растворения) хлоргексидинового основания, т.е. использование его не в виде солей (биацитата, биглюконата, дигидрохлорида), а напрямую, усиливает его эффективность более чем в 100 раз [9] и является научным прорывом в возможности создания нового поколения медицинских препаратов.
Продукты, получаемые на основе подобной технологии, будут эффективны против всех типов микроорганизмов - бактерий, грибов, простейших, вирусов, архей, их резистентных штаммов и форм - спор, L-форм, а также микроорганизмов внутри биопленок, где их устойчивость может быть в 100-1000 раз выше, чем у так называемых планктонных форм [9].
Данный технологический метод позволяет снизить токсичность препарата для клеток эукариотов макроорганизма вследствие его локации внутри нанокапсул аминооксида благодаря улучшению фармакокинетических параметров действующего соединения, обеспечения защиты активной субстанции от агрессивного воздействия внутренней окружающей среды человеческого организма, а также последующее безопасное удаление естественным путем. Все вышеизложенное доказывает перспективность подобного подхода.
Создан абсолютно новый принцип, позволяющий капсулировать любые антивирусные и противобактериальные вещества. Капсулы, жидкокристаллические мицеллы из олигомеров стабильны, поскольку экранированы нейтральным зарядом, что позволяет молекуле активно действующего вещества сохранять антиинфектогенную активность и воздействовать непосредственно на мишень - возбудитель инфекционной болезни [10, 11].
Существующие в настоящее время в мировой практике способы капсулирования действующих веществ основаны на липосомальной технологии или использовании наноматериалов (фуллеренов и др.) [10].
Заключение
На примере вышеизложенных результатов проведенной работы доказан выраженный противовирусный и бактерицидный эффект нанокапсулированных на основе аминооксида соединений ХО, что свидетельствует о перспективности разработки и использования их, а также метода капсулирования как способа доставки лекарственных веществ внутрь клетки эукариотов для профилактики и терапии широкой палитры инфекционных заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Farkas E., Kiss D., Zelkó R. Study on the release of chlorhexidine base and salts from different liquid crystalline structures // Int. J. Pharm. 2007. Vol. 340, N 1-2. P. 71-75. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.03.038 PMID: 17467206.
2. Львов Н.Д., Панюкова Е.М., Никитина А.А. Современные методы экспресс-диагностики герпесвирусной инфекции различной локализации. Клинико-вирусологические параллели // Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности Российской Федерации : учебно-методическое пособие для факультетов последипломного образования по специальностям: вирусология, инфекционные болезни, иммунология и эпидемиология. Москва : Изд-во Первого МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России, 2014. С. 129-137.
3. Львов Н.Д. Герпесвирусы - недооцененная угроза человечеству // Сборник VII Научно-практической конференции с международным участием "Здоровье иммунной системы. Иммунотропная инфекция. Новые опухолевые маркеры". Москва : ФГБУ Поликлиника № 1 УДП РФ, 16 марта 2018. С. 49-58.
4. Львов Н.Д. Герпесвирусы человека - системная интегративная иммунопатология // РМЖ. 2012. № 22. С. 1133-1137.
5. Ершов Д.И., Романцов М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях : руководство для врачей. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2007.
6. Samad A., Sultana Y., Aqil M. Liposomal drug delivery systems: an update review // Curr. Drug Deliv. 2007. Vol. 4, N 4. P. 297-305.
7. Львов Н.Д. Герпесвирусные инфекции - общая характеристика. Монография. Глава 2.3.3.1. Вирусные инфекции кожи и слизистых оболочек. // Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / под ред. Д.К. Львова. Москва : Медицинское информационное агентство, 2013. С. 599-603.
8. De Bolle L., Naesens L., De Clercq E. Update on human herpesvirus 6 biology, clinical features, and therapy // Clin. Microbiol. Rev. 2005. Vol. 18, N 1. P. 217-245. DOI: https://doi.org/10.1128/CMR.18.1.217-245.2005 PMID: 15653828; PMCID: PMC544175.
9. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. I. Москва : Гриф и К, 2012. 944 с.
10. Ноздрачев А.Д., Марьянович А.Т., Поляков Е.Л., Сибаров А.Д., Хавинсон В.Х. Нобелевские премии по физиологии и медицине за 100 лет. Санкт-Петербург : Гуманистика, 2002. 688 с.
11. Павлова И.Б., Кононенко А.Б., Толмачева Г.С., Рыцарев А.Ю. Формирование биопленок патогенными бактериями и воздействие на них нового дезинфицирующего препарата // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2018. № 4. С. 56-62.