Совершенствование методической базы обучения методам лабораторной диагностики туляремии

• Сазанова Елена Владимировна
• Малюкова Татьяна Анатольевна
• Попов Юрий Алексеевич
• Бойко Андрей Витальевич
• Сеничкина Айслу Мухамятовна
• Абдрашитова Адиля Саберьжановна
• Щербакова Наталья Евгеньевна
• Ляшова Ольга Юрьевна
• Терехова Ирина Викторовна
• Вахрушина Наталья Ивановна

Резюме

Обучение бактериологов, эпидемиологов и лаборантов, работающих с возбудителями I-II групп патогенности, требует формирования пула штаммов микроорганизмов, характеризующихся сниженной вирулентностью. Стандартизированный учебный набор штаммов позволяет выполнить в полном объеме план учебного модуля на практических занятиях по освоению регламентированных методов лабораторной диагностики.

Цель исследования - подбор штаммов Francisella tularensis со сниженной вирулентностью для формирования стандартизованного учебного набора.

Материал и методы. Исследования штаммов Francisella проводили с помощью аналитического, микробиологического, молекулярно-биологического, иммунодиагностических и биологического методов, масс-спектрометрического анализа.

Результаты и обсуждение. Подобраны штаммы F. tularensis, разработаны алгоритм и дифференцированный подход использования каждого штамма при освоении регламентированных методов индикации и идентификации возбудителя туляремии. Разработаны стандартные учебные образцы проб - имитаторов патогенного биологического агента для проведения практических занятий.

Заключение. Применение учебного набора штаммов F. tularensis позволяет минимизировать риск лабораторного инфицирования обучающихся на курсах профессиональной переподготовки и освоить в полном объеме методы индикации и идентификации туляремийного микроба, регламентированные на территории Российской Федерации.

Ключевые слова:Francisella tularensis; учебный набор штаммов; подготовка специалистов; биологическая безопасность; лабораторная диагностика туляремии

Одним из основных государственных направлений в сфере охраны здоровья населения является обеспечение качественной профессиональной подготовки специалистов учреждений Роспотребнадзора, медицинских и иных организаций по лабораторной диагностике инфекционных болезней. Обучение бактериологов, эпидемиологов и лаборантов регламентированным методам лабораторной диагностики туляремии проводят в ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора с 1924 г. с использованием вирулентных штаммов [1].

Государственная политика в области обеспечения биологической безопасности Российской Федерации ставит задачу исключить или минимизировать использование в технологических процессах патогенных микроорганизмов [2]. Данный подход может быть реализован путем формирования пула штаммов микроорганизмов, характеризующихся сниженной вирулентностью и позволяющих выполнить в полном объеме план учебного модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии" на практических занятиях при освоении регламентированных методов лабораторной диагностики туляремии. Необходимо подчеркнуть, что преподавание модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии", согласно учебной программе, основывается на теоретических (лекции, семинары) и обязательных практических занятиях. Важная роль практических занятий в программе профессиональной переподготовки эпидемиологов, бактериологов и лаборантов определяет количество учебных часов, выделяемых для овладения регламентированными методами лабораторной диагностики туляремии, которое в 3 раза превышает учебное время, отведенное на освоение теоретического материала.

Практические занятия для слушателей курсов проводят с учетом современных требований биологической безопасности, положений профессиональных стандартов и квалификационных характеристик специалистов. Предусмотрено не только решение ситуационных задач с моделированием эпидемических ситуаций, но и использование проб - имитаторов материалов, содержащих F. tularensis, что способствует формированию знаний биологических свойств возбудителя туляремии. Полученные знания позволят оперативно организовать проведение индикации и идентификации возбудителей при возникновении вспышек инфекционных болезней.

Следует отметить, что с целью максимального снижения вероятного риска лабораторного инфицирования обучающихся при изучении биологических свойств возбудителя туляремии возможно использование только одного штамма, применяемого для вакцинации людей - F. tularensis 15 НИИЭГ (подвид holarctica). Однако данный штамм не может обеспечить изучение всего разнообразия микробиологических свойств других таксономических подвидов - tularensis, mediasiatica и novicida [3].

В связи с этим предварительно был проведен информационный поиск штаммов F. tularensis, перспективных для использования в учебном процессе. В поисковой системе найдены патенты с описанием способа получения вакцинных штаммов возбудителя туляремии путем селекции из чистой линии бактерий R-формы штамма F. tularensis 15 НИИЭГ [4]. Запатентован набор штаммов бактерий вида F. tularensis для получения контрольных ДНК препаратов, применяемый для генетических исследований [5]. Имеется патент, в котором описан аттенуированный штамм F. tularensis В 399 A-CoLe Strr 2500/K для разработки живой вакцины, являющийся стрептомицин-резистентным мутантом [6]. Однако использование этого штамма в учебном процессе возможно только при его чувствительности не менее чем к 2 антибактериальным препаратам (СанПиН 3.3686-21 п. 202). Таким образом, в ходе информационного поиска не удалось обнаружить сведений о штаммах или наборе штаммов F. tularensis, применяемых для освоения комплекса регламентированных методов лабораторной диагностики туляремии. Вместе с тем штамм F. tularensis В 399 A-CoLe Strr 2500/K был рассмотрен как перспективный для формирования учебного набора штаммов.

Цель исследования - подбор штаммов F. tularensis для формирования стандартизованного учебного набора.

Материал и методы

В работе использованы нормативные и методические документы по лабораторной диагностике туляремии и биобезопасности работ с патогенными биологическими агентами (ПБА); учебные программы профессиональной переподготовки для работ с возбудителями особо опасных инфекций (ООИ); паспорта штаммов F. tularensis, депонированных в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора; открытые научно-технические источники информации. В соответствии с паспортными данными отобраны 8 штаммов различных подвидов F. tularensis: 1 штамм - вакцинный; 2 - кандидаты в вакцинные, не прошедшие государственные испытания и 5 - вирулентные.

Методы исследования: аналитический, микробиологический, молекулярно-биологический, иммунологические, биологический и масс-спектрометрический анализ. Культурально-морфологические, биохимические свойства изучали с помощью регламентированных методов, изложенных в методических документах по лабораторной диагностике туляремии [7-9]. Штаммы F. tularensis выращивали на FT-агаре при температуре 37±1 °С в течение 48-72 ч.

Обнаружение видоспецифического антигена липополисахарида (ЛПС) проводили с помощью методов флюоресцирующих антител (МФА), иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографического анализа (ИХА) и реакции агглютинации специфической сывороткой (РА). Использовали медицинские изделия для in vitro диагностики "Иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие сухие", "Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная", сыворотка диагностическая туляремийная сухая для РА, иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии "ИХ тест F. tularensis". Работу осуществляли в соответствии с инструкциями фирм производителя.

Регистрацию результатов матрично-активированной лазерной деcорбционно/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) проводились на масс-спектрометре Bruker Daltonics (Германия) серии Microflex™ LT с использованием программы Flex Control 3.4. Запись спектров была проведена в автоматическом режиме при частоте лазера 60 Гц в диапазоне масс от 2000 до 20 000 Да. Для получения одиночного масс-спектра использовали 40 импульсов лазера. Генерация спектра, анализ и обработка спектров были проведены с помощью программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия). Обеззараживание и приготовление экстрактов исследуемых штаммов микроорганизмов проводили в соответствии с МУК 4.2.3733-21 "Подготовка культур микроорганизмов I-II групп патогенности для анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и создание баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов". В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Оценку масс-спектров проводили с помощью Flex Analysis 3.4 (Bruker Daltonics GmbH, Германия), выполняя сглаживание и вычитание базовой линии.

Выявление генетических маркеров, специфичных для возбудителя туляремии, осуществляли с помощью наборов реагентов в соответствии с инструкциями производителей и методическими указаниями [10]. Для определения вида F. tularensis использовали "Набор реагентов для выявления ДНК Francisella tularensis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ген Francisella tularensis - РГФ)", для идентификации и подвидовой дифференциации штаммов F. tularensis - "Набор реагентов для ускоренной идентификации штаммов F. tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ген Francisella tularensis - подвид РГФ)" и "Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Туляремия-РВ)".

Для моделирования проб-имитаторов использовали коммерческие препараты, имитирующие биологические жидкости человека и сельскохозяйственного животного (сыворотка диагностическая туляремийная, а также сыворотка крови лошади), аллерген туляремийный жидкий (Тулярин), диагностикум туляремийный, физиологический раствор; нелинейные (аутбредные) белые мыши и блохи (инсектарий ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора).

С использованием штаммов микроорганизмов учебного набора разработаны образцы: 8 проб - клинического материала; 1 проба - исследование сыворотки крови больного туляремией сельскохозяйственного животного; 2 пробы - грызуны, привезенные с полей; 1 проба - исследование кровососущих членистоногих на содержание возбудителя туляремии; 3 пробы - объекты окружающей среды, предназначенные для решения ситуационных бактериологических задач.

Вирулентность штаммов оценивали на нелинейных белых мышах массой тела 18-20 г, полученных из производственного комплекса по разведению экспериментальных животных ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора. Заражали белых мышей подкожно в область внутренней поверхности бедра взвесью, приготовленной из 48-часовой агаровой культуры F. tularensis в объеме 0,2 мл. Испытывали 4 дозы с 10-кратными разведениями от 5×103 до 5 КОЕ/мл. Наблюдение за зараженными мышами проводили в течение 15 дней. Павших лабораторных животных вскрывали, изучали патологоанатомическую картину и проводили посев паренхиматозных органов на FT-агар с целью выделения F. tularensis. Показатель вирулентности (LD50) рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [11].

Эксперименты на лабораторных животных проводили в соответствии с требованиями действующих Санитарно-эпидемиологических правил и этическим кодексом по проведению медико-биологических исследований [12, 13].

Результаты и обсуждение

Для формирования учебного набора штаммов для модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии" были проанализированы нормативные и методические документы по лабораторной диагностике туляремии, обеспечению биологической безопасности при работе с патогенными биологическими агентами и разработанные ранее критерии по подбору штаммов F. tularensis в качестве учебных [7-9, 14, 15].

Результаты анализа позволили детализировать критерии выбора штаммов F. tularensis для учебных целей:

· вирулентность для белых мышей (LD50) при подкожном введении должна быть не менее 1×102 КОЕ [15] (вследствие отсутствия четких критериев, дающих возможность разделить штаммы F. tularensis по вирулентности, в основу первого критерия был взят количественный показатель "остаточная вирулентность", предъявляемый к вакцинным штаммам);

· типичные для вида и подвидов культуральные и фи­зиолого-биохимические свойства F. tularensis;

· наличие комплекса свойств для проведения внутривидовой дифференциации возбудителя туляремии, различающихся по способности ферментировать глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, глицерин, цитруллинуреидазу, а также по фосфатазной и β-лактамазной активности;

· наличие генетических маркеров, специфичных для вида F. tularensis (iglBC) и подвидов [ISFtu2, FTT1670c, FTT_1272 (A), FTT_1272 (G), ISFtu5];

· различия в структуре ЛПС у подвидов tularensis, mediasiatica, holarctica и novicida, выявляющиеся с помощью иммунологических методов исследования;

· способность формировать патологоанатомические изменения (картина острого сепсиса) во внутренних органах лабораторных животных;

· чувствительность к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики туляремии.

С учетом вышеперечисленных критериев, паспортных данных и современной внутривидовой классификации возбудителя туляремии были отобраны для дальнейшего изучения 8 штаммов, из которых 2 отнесены к подвиду tularensis: Schu 7; В399А-Cole Strr 2500/k; 3 - к подвиду mediasiatica: А-61(117); А-142 (112); А-148; 2 - к novicida: Like F 6168; Utah 112 (АТСС 15482) и 1 - к подвиду holarctica 15 НИИЭГ. Все штаммы отнесены к ПБА II группы патогенности, исключение составляет F. tularensis 15 НИИЭГ (III группа патогенности).

Подобранную группу штаммов, перспективных в качестве учебных, изучили по спектру тинкториальных, культурально-морфологических и основных биохимических свойств в соответствии с практическим руководством "Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней" [7]. В мазках, приготовленных по методу Грама, клетки изучаемых штаммов имели вид отрицательно окрашенных коккобацилл. Культивирование штаммов F. tularensis подвидов holarctica и tularensis на питательной среде FT-агар характеризовалось формированием в течение 48-72 ч зрелых колоний в S-форме диаметром около 1,5 мм, слизистых, блестящих, хорошо снимающихся петлей с поверхности агаровой пластины. Рост бактерии подвида mediasiatica отличался формированием более мелких колоний диаметром не более 1 мм, штаммы подвида novicida образовывали крупные колонии диаметром 2 мм через 24-48 ч инкубации.

Все штаммы, кроме F. tularensis В399А-Cole Strr 2500/k, были чувствительны к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики туляремии.

Одним из этапов подвидовой идентификации возбудителя туляремии является изучение биохимических свойств по совокупности ряда признаков: ферментации глюкозы, мальтозы, глицерина, наличию или отсутствию цитруллинуреидазной, фосфатазной, β-лактамазной активности. По совокупности характеристик была подтверждена принадлежность отобранных штаммов к определенному подвиду. Штаммы F. tularensis subsp. mediasiatica ферментировали глицерин, имели цитруллинуреидазную и фосфатазную активность, но отсутствовала β-лактамазная активность. Штаммы F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. novicida характеризовались ферментацией глицерина, цитруллинуреидазной, β-лактамазной, фосфатазной активностью; штамм F. tularensis subsp. holarctica отличался отсутствием цитруллинуреидазы, фосфатазы, ферментации глицерина и наличием β-лактамазной активности. Таким образом, отобранные штаммы дают возможность выработать у обучающихся навыки определения подвидов.

Лабораторная диагностика туляремии у человека и животных включает использование регламентированных методов, направленных на выявление как антител к возбудителю, так и его антигенов. Поэтому отобранные штаммы были исследованы с помощью иммунологических методов (МФА, РА, ИХА, ИФА, РНГА) для выявления ЛПС разных подвидов F. tularensis. При иммунологической идентификации отобранных штаммов выявляли как положительные результаты (штаммы F. tularensis подвидов tularensis, mediasiatica и holarctica), так и отрицательный (F. tularensis subsp. novicida), что связано с особенностями химической структуры О-антигена у данного подвида [16].

В результате ПЦР-анализа исследуемых штаммов определены генетические маркеры, специфичные для вида F. tularensis - iglBC гены и соответствующие подвидам локусы ISFtu2, FTT1670c, FTT_1272 (A), FTT_1272 (G), ISFtu5 (табл. 1).

По результатам идентификации установлено, что все исследуемые штаммы туляремийного микроба содержат видоспецифичные гены iglBC. У штаммов F. tularensis подвида tularensis выявлены локусы FTT 1670c, FTT_1272 (G), ISFtu5; у штаммов подвида mediasiatica - локусы FTT 1670c, FTT_1272 (A), ISFtu5; у штамма подвида holarctica - локусы ISFtu2, FTT_1272 (A), ISFtu5, у штаммов подвида novicida - только локусы FTT 1670c и FTT_1272 (A). Полученные данные в полной мере соответствуют типичной для вида и подвидов возбудителя туляремии молекулярной характеристике.

Для дополнительного подтверждения внутривидовой идентификации был проведен масс-спектрометрический анализ. В результате применения метода MALDI-TOF MS установлено наличие у данных штаммов общих родо- и видоспецифичных масс-пиков (3070, 3156, 4737, 5181, 6142, 6768, 9475, 10245±5 КДа). Также были обнаружены белки с массой 6730 и 7800 Да, которые были предложены как маркеры для F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. holarctica соответственно [17]. В результате идентификации F. tularensis subsp. с помощью MALDI-TOF MS значения оценочного коэффициента (Score) составили от 2,02 до 2,35, что достоверно подтверждало видовую принадлежность изучаемых штаммов F. tularensis. Известно, что при значении оценочного коэффициента Score >2 результат соответствует надежной идентификации до вида, а Score >2,5 - до подвида [18]. Однако, несмотря на то что значения Score не превышали 2,5, идентификация данных штаммов до подвида при масс-спектрометрическом анализе в 100% случаев совпала с паспортными данными и результатами подвидовой дифференциации в ПЦР (табл. 2).

Оценку вирулентных свойств отобранных штаммов F. tularensis проводили in vivo. Павших лабораторных животных вскрывали, фиксировали изменения во внутренних органах (картина острого сепсиса) с выделением культуры туляремийного микроба на FT-агаре из лимфатических узлов и паренхиматозных органов. Сравнивая данные, представленные в табл. 2, было отмечено, что при заражении нелинейных белых мышей штаммы 4 подвидов туляремийного микроба можно разделить на 3 группы. 1‑ю группу составили наименее вирулентные штаммы, относящиеся к подвиду novicida; во 2‑ю вошли штаммы со сниженной вирулентностью подвидов tularensis и holarctica; в 3‑ю - вирулентные штаммы подвида mediasiatica.

Таким образом, учитывая проведенную статистическую обработку данных по показателю (LD50) и основной критерий "остаточная вирулентность", были отобраны перспективные штаммы для включения в учебный набор, а именно F. tularensis Utah112 (АТСС15482), 15 НИИЭГ, 7 Schu, А-61(117). Выбранным критериям соответствовали штаммы подвидов novicida, holarctica, tularensis. Представителя подвида mediasiatica, несмотря на превышение величины LD50 для белых мышей, необходимо включить в набор штаммов для реализации практических занятий по изучению слушателями курсов типичных биологических свойств подвида mediasiatica, а также демонстрации выраженной патологоанатомической картины при заражении лабораторных животных (интенсивная гиперемия сосудов подкожной клетчатки, формирование участков некроза в тканях селезенки и печени).

Вместе с тем полученные данные о вирулентности отобранных штаммов F. tularensis послужили основанием для разработки дифференцированного подхода к использованию их на практических занятиях при освоении слушателями курсов регламентированных методов индикации и идентификации туляремийного микроба в рамках учебных тем модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии" (табл. 3).

Таким образом, вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ может быть использован для индивидуальной работы слушателями курсов и преподавателями на всех этапах обучения регламентированным методам исследования; штаммы подвидов novicida, holarctica, tularensis tularensis и mediasiatica - только для демонстрации тестов преподавателями.

Разработаны стандартные учебные образцы, имитирующие пробы биологического материала и объектов окружающей среды, содержащие возбудителя туляремии, а также панель проб для освоения исследования материала с помощью ПЦР, для решения бактериологических задач с целью контроля полученных знаний и умений у слушателей курсов.

Заключение

Сформирован и протестирован набор штаммов F. tularensis, который может быть использован на курсах не только профессиональной переподготовки, но и повышения квалификации врачей-бактериологов, эпидемиологов, лаборантов. В рамках проведения практических занятий слушатели курсов имеют возможность самостоятельно отработать технику постановки регламентированных методов индикации и идентификации возбудителя туляремии с интерпретацией результатов. Предложенный набор штаммов позволяет безопасно проводить постановку ПЦР для формирования у обучающихся умения дифференцировать подвиды F. tularensis.

Работа преподавателя с комплектом штаммов возбудителя туляремии предоставляет возможность подготовить пробы-имитаторы ПБА, в том числе для ПЦР анализа с целью демонстрации определения подвидовой дифференциации F. tularensis. Использование отобранных штаммов при подкожном заражении позволит продемонстрировать патологоанатомическую картину туляремии у лабораторных животных.

Подана заявка на получение патента "Комплект штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза".

ЛИТЕРАТУРА

1. Попов Ю.А., Малюкова Т.А., Тихомирова Л.А., Кутырев В.В. Система подготовки специалистов по биологической безопасности в Российской Федерации // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2016. № 1 (14). С. 11-18.

2. Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу: приказ Президента РФ от 01.11.2013 № Пр-2573.

3. Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Garrity G.M. (eds). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2: the Proteobacteria. Part A. Introductory essays. Boston : Springer, 2005. 304 p.

4. Пат. RU 2 308 969 A61K39/02 А61К35/74 С12N1/00 A61P31/04. Живая туляремийная вакцина Nik-sp. Francisella tularensis / Кисличкин Н.Н., Кисличкина О.И., заявл. 2006-06-16, опубл. 27.10.2007.

5. Пат. SU № 1839960 С12Т1/60 А61К39/02. Штамм бактерий Francisella tularensis для приготовления живой вакцины против туляремийной инфекции / Кормилицына М.И., Маракуша Б.И., Петровская В.Г., Мещерякова И.С. заявл. 19.01.1987, опубл. 20.06.2006.

6. Пат. RU 2 443 772 C1 C12N C12Q C12N C12R. Набор штаммов бактерий вида Francisella tularensis для получения комплекта контрольных ДНК препаратов, комплект ДНК препаратов для генно-диагностических исследований. / Осина Н.А., Уткин Д.В., Сеничкина А.М., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. заявл.26.07.2010, опубл. 27.02.2012.

7. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней : практическое руководство / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. 2-е изд., перераб. Москва : Шико, 2013. 560 с. ISBN 978-5-900758-68-8.

8. Эпидемиологический надзор за туляремией: методические указания МУ 3.1.2007-05. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2005. 142 с.

9. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: методические указания МУК 4.2.2939-11. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. 59 с.

10. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности МУ 1.3.2569-09. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 51 с.

11. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград : Медгиз, 1962. 180 с.

12. Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней: санитарно-эпидемиологические правила и нормы СанПиН 3.3686-21. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 28.01.2021. 1091 с.

13. Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. CIOMS. Geneva, 1985. 1 c.

14. Сазанова Е.В., Осина Н.А., Горельникова Е.А., Попов Ю.А. Пути совершенствования освоения лабораторной диагностики туляремии на курсах дополнительного профессионального образования // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 9, № 3. C. 133-138. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2020-9-3-133-138 (in Russian)

15. Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба: методические указания МУ 3.3.1.2161-07. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 51 с.

16. Vinogradov E., Perry M.B., Conlan J.W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. Article ID 61126118. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1432-1033.2002.03321.x

17. Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В. MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015. № 2. С. 3-8.

18. Regoui S., Hennebique A., Girard T., Boisset S., Caspar Y., Maurin M. Optimized MALDI TOF mass spectrometry identification of Francisella tularensis subsp. holarctica // Microorganisms. 2020. Vol. 8, N 8. P. 1143. DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms8081143 PMID: 32731606.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)