Оценка эффективности применения конъюгатов куриных IgY антител к IgG человека в иммуноферментном анализе и дот-иммуноанализе
РезюмеЦель работы - сравнительная оценка куриных (IgY) и мышиных моноклональных (IgG) антител к IgG человека в качестве зонда для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа при диагностике клещевого энцефалита.
Материал и методы. Проведены эксперименты по сравнению способности зондов на основе мышиных IgG и куриных IgY антител к IgG человека, а также протеинов А и G, связанных с пероксидазой хрена и коллоидным золотом, определять человеческие иммуноглобулины разных классов, а также выявлять в сыворотке крови человека IgG, специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ). В качестве реагента захвата в ИФА и дот-анализе использовали рекомбинантный аналог домена III гликопротеина Е ВКЭ. Исследования выполнены в сравнении с коммерческим набором "ВектоВКЭ-IgG" с применением панелей сывороток крови, содержащих антитела к ВКЭ, желтой лихорадке и денге, а также образцов от здоровых доноров.
Результаты и обсуждение. Показано, что сконструированные экспериментальные наборы для ИФА и дот-анализа адекватно определяют положительные и отрицательные образцы и позволяют дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к другим флавивирусам. Зонды с пероксидазой и коллоидным золотом обеспечивают одинаковые лимиты обнаружения IgG, а зонды на основе куриных антител демонстрируют более интенсивные оптические сигналы и преимущества в чувствительности по сравнению с конъюгатами мышиных IgG.
Заключение. Полученные данные позволяют рассматривать конъюгаты на основе куриных антител в качестве перспективных реагентов для иммуноанализа.
Ключевые слова:IgY; IgG; клещевой энцефалит; конъюгаты; иммунодиагностика; дот-иммуноанализ; иммуноферментный анализ
Финансирование. Исследование проведено в рамках выполнения государственного задания Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Полтавченко А.Г.; проведение экспериментов - Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д.,Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н.; анализ и интерпретация данных - Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Филатов П.В.; подготовка текста - Полтавченко А.Г., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В.
Для цитирования: Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. Оценка эффективности применения конъюгатов куриных IgY антител к IgG человека в иммуноферментном анализе и дот-иммуноанализе // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2024. Т. 13, № 1. С. 6-14. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2024-13-1-6-14
Выбор эффективного иммунореагента детекции - белка, используемого для изготовления зонда (конъюгата с легко выявляемой меткой), является важным этапом при создании иммунохимического теста, поскольку от правильного выбора во многом зависит успешность анализа. В серологических тестах при выявлении антител в качестве детекторных белков используют вторичные иммунореагенты - моно- и поликлональные антитела к выявляемым иммуноглобулинам или белки, связывающиеся с константными фрагментами (Fc) антител: протеин А из Staphylococcus aureus (SpA) и протеин G, выделяемый из стрептококков (SpG). Их качество зависит от способа получения и хранения [1] и может значительно различаться в продуктах из разных источников. Выбор наиболее подходящего компонента, как правило, проводят на основе сравнительных экспериментов. Критериями выбора служат чувствительность и специфичность выявления целевого аналита, эффективность связывания с меткой, а также доступность и стоимость детекторного белка. В последнее время значительный интерес вызывают выделяемые из желтка куриных яиц антитела IgY как альтернатива антителам млекопитающих [2]. Интерес к использованию IgY-технологии объясняется биоэтическими преимуществами [3], возможностью получения большого количества высокоактивных и специфичных антител с относительно низкими затратами [4], простотой и эффективностью выделения IgY из яиц [5], легкостью масштабирования производства антител в широком диапазоне [4], а также уникальными свойствами куриных антител, что определяет их успешное применение с диагностическими и иммунотерапевтическими целями [2, 4, 6, 7].
Подобно IgG млекопитающих, IgY состоит из двух тяжелых (H) и двух легких (L) полипептидных цепей, которые организованы в Y-образную характерную "единицу" и содержат 2 идентичных активных центра связывания антигена. Однако структура и физико-химические характеристики IgY отличаются от IgG, что приводит к различиям в их свойствах и оказывает значительное влияние на стабильность, иммуногенность и биологическую активность [3, 6]. Известны примеры получения и эффективного применения зондов на основе антивидовых и специфичных к отдельным белкам IgY антител, связанных с пероксидазой [3, 8], коллоидным золотом [7, 9] и другими метками [7, 10]. Большинство полученных данных свидетельствует о том, что применение куриных антител в иммуноанализе способствует повышению чувствительности и минимизации ложных сигналов. В то же время некоторые авторы приводят случаи слабой иммунореактивности организма кур и низкой аффинности полученных антител при иммунизации некоторыми антигенами [10]. Отмечают низкую эффективность IgY в тестах иммунопреципитации [8], меньшую чувствительность тест-систем на основе IgY по сравнению с тестами на основе IgG [11] и делают выводы о необходимости при создании методов с использованием желточных иммуноглобулинов проводить сравнения с методами, в которых используются иммуноглобулины млекопитающих [10].
Цель работы - сравнительная оценка куриных (IgY) и мышиных моноклональных (IgG) антител к IgG человека в качестве зонда для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа при диагностике клещевого энцефалита.
Материал и методы
Проведено сравнительное экспериментальное исследование по оценке эффективности выявления в образцах сывороток крови специфических антител к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) с использованием экспериментальных наборов реагентов для проведения ИФА и дот-иммуноанализа.
Иммунореагенты
Реагенты захвата - мышиные моноклональные антитела (МКАТ) к IgG человека (I4506), бактериальные белок А (P6031) и белок G (O8062) производства Sigma-Aldrich (США).
Аналиты - антитела IgМ человека (H Imm), IgА человека (Н Iаа), IgG человека (H Igg) производства "Имтек" (Россия).
Получение поликлональных антител IgY курицы к IgG человека и конъюгатов с пероксидазой хрена
Кур иммунизировали препаратом Иммуноглобулин человека нормальный (НПО "Микроген", Россия), смешанным в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (Sigma-Aldrich, США), в дозе 500 мкг/животное. Препарат (100 мкг/мл) вводили внутримышечно в грудные мышцы птицы. Иммунизацию повторяли на 10, 22, 32, 44, 56 и 68‑е сутки, используя неполный адъювант Фрейнда. Собранные от иммунизированных кур яйца хранили при 4 °С. Выделение антител из яиц проводили по ранее описанному способу [5]. Получение конъюгатов пероксидазы хрена с поликлональными куриными IgY (HRP-Chicken IgY-a/Hum) и моноклональными мышиными IgG (HRP-Mouse IgG-a/Hum) проводили по методу Nakano и Kawaoi [12].
Получение зондов с коллоидным золотом
Определение дозы нагрузки и связывание золя золота (20 нм) с детекторными белками выполняли по ранее описанной методике [13]. Таким способом получены зонды коллоидного золота с протеином А (Au-SpA), протеином G (Au-SpG), МКАТ мыши к IgG человека (Au-Mouse IgG-a/Hum) и куриными антителами к IgG человека (Au-Chicken IgY-a/Hum).
Получение рекомбинантного аналога домена III гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита
Синтез гена, кодирующего фрагмент оболочного белка E вируса КЭ, соответствующий домену III (EDIII-ВКЭ) штамма Glubinnoe/2004 [GenBank: DQ862460.1], выполняли в OOO "ДНК-Синтез" (Россия). Наработку, выделение и очистку белка проводили аналогично методике, приведенной в предыдущей работе [14].
В работе использовали: тетрахлорзолотую кислоту [ТХЗК (HAuCl4)], лимонную кислоту, твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), thimerosal, казеин и натрия азид (Sigma-Aldrich, США); другие химические реактивы отечественного производства с квалификацией не ниже "ч.д.а." ("чистый для анализа". - Примеч. ред.). Для изготовления подложки иммуночипов применяли синтетический материал на основе ПВХ Zenofol Print ("Зенон", Россия).
Образцы сывороток крови
В экспериментах использовали пул сывороток крови человека, содержащий:
· панель I из 20 образцов сывороток крови сотрудников ГНЦ ВБ "Вектор", привитых против клещевого энцефалита (КЭ). Отбор и использование сывороток крови одобрены на заседании этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора № 6 от 18.04.2023 и проведены в соответствии с информированным согласием;
· панель II - панель образцов, содержащих и не содержащих антитела к ВКЭ, включающую 20 серопозитивных сывороток крови больных или переболевших клещевым энцефалитом и 15 серонегативных образцов сывороток крови доноров, которые были предоставлены ООО "Имбиан-Лаб" (Россия);
· панель III, включающую 10 сывороток крови, полученных от сотрудников ГНЦ ВБ "Вектор", вакцинированных против желтой лихорадки. Участие в исследовании одобрено на заседании этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора № 4 от 14.04.2022 и проведено в соответствии с их информированным согласием;
· панель IV - верификационная панель для лихорадки денге, состоящая из 9 образцов сыворотки крови, содержащих антитела к вирусу денге (Dengue Fever Verification panel, KZMC028), производства ZeptoMetrix®, LLC (США).
При проведении экспериментов все образцы подвергались кодированию.
Иммуноферментный анализ
Определяемые аналиты (IgA, IgM и IgG) разводили в 0,01 М карбонатном буферном растворе (рН 9,4) до концентрации 400 нг/мл, из которой готовили серии двукратных разведений от 400 до 3 нг/мл и выполняли их иммобилизацию в высокосорбционных планшетах Nest (Китай) в течение 20 ч, при температуре +4 оС из объема 100 мкл. Рекомбинантный белок ЕDIII-ВКЭ с концентрацией 1 мкг/мл сорбировали в ячейках планшета таким же образом. ИФА выполняли по стандартной методике [14]. Результаты учитывали спектрофотометрически - оптическая плотность при длине волны 450 нм (ОП450).
Дот-иммуноанализ
В экспериментальных наборах дот-иммуноанализа твердой фазой являлась подложка из синтетической бумаги, на рабочую сторону которой дискретно каплями по 2,5 мкл наносили двукратные разведения аналитов (от 400 до 3 нг/мл) или белок ЕDIII-КЭ (2,6 мкг/мл) в 0,01 М боратном буферном растворе (рН 6,0). В качестве контроля работоспособности конъюгата на подложку наносили IgG человека в концентрации 2,5 мкг/мл в том же буферном растворе. Подложки инкубировали 12 ч при 4 °С и высушивали при 40 °С в течение 2 ч. Блокировку свободных от антигенов участков поверхности осуществляли 0,2% раствором казеина на 0,01 М фосфатном буферном растворе (рН 7,2) в течение 2 ч при комнатной температуре. Дальнейшую подготовку подложек и выполнение анализа проводили по ранее приведенной методике [15].
При учете результатов изображение матриц оцифровывали с помощью планшетного сканера и обрабатывали с использованием специальной компьютерной программы, оценивающей интенсивность окраски на местах нанесения соответствующих иммунореагентов в относительных единицах светопоглощения. За положительный результат принимали значение, превышающее отсекаемые значения оптической плотности отрицательного результата (ОПкрит).
Контрольная тест-система
Сравнительные эксперименты по оценке эффективности выявления в образцах сывороток крови специфических антител к ВКЭ выполняли с использованием коммерческого набора реагентов для иммуноферментного выявления и количественного определения IgG к ВКЭ ВектоВКЭ-IgG (D-1156) РУ № РЗН 2017/5605 от 04.2017 АО "Вектор-Бест".
Статистическая обработка
Все эксперименты выполняли в 5 повторах. При статистической обработке полученных данных с помощью программного продукта Microsoft Excel вычисляли: среднее (M), стандартное отклонение σ, доверительный интервал (±∆х) для вероятности 95% (р=0,95, α=0,05), коэффициент вариации (V). Отсекаемые значения (ОПкрит) для каждого вида анализа высчитывали как M+∆х по всему пулу отрицательных донорских сывороток крови. Диагностические чувствительность и специфичность теста оценивали по ГОСТ Р 53022.3-2008. Достоверность различий результатов, полученных с применением экспериментальных тестов и теста сравнения, оценивали путем расчета критерия χ2 по методике Макнемара с использованием онлайн-ресурса https://medstatistic.ru/index.php. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Описанные ниже исследования проведены в рамках проекта по созданию автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям клещевых инфекций - клещевого энцефалита, боррелиоза, риккетсиоза и др. Мультиплексный дот-иммуноанализ антител выполняется на плоских плотных подложках с дискретно нанесенными в определенном порядке антигенами возбудителей инфекционных заболеваний. При выполнении анализа матрицу последовательно инкубируют с исследуемым образцом крови и зондом - вторичным иммунореагентом, связанным с коллоидным золотом. Частицы золота, иммобилизованные на подложке за счет иммунного связывания, проявляют в кислом растворе, содержащем растворимую соль серебра и восстановитель (метол, гидрохинон и др.). Серебро из такого нестабильного раствора способно каталитически восстанавливаться на частицах золота. Учет результатов анализа основан на обнаружении темной окраски восстановленного серебра в определенных зонах на подложке [13].
В качестве иммунореагентов детекции используют вторичные антитела от разных животных, направленные против антител человека, или бактериальные протеины А и G, способные связываться с константной частью (Fc-фрагмент) антител человека и некоторых животных. Эффективность таких конъюгатов зависит от качества реагентов детекции, успешности процедуры связывания этих реагентов с поверхностью частиц коллоидного золота и способности этих частиц восстанавливать серебро, не дестабилизируя проявитель. Изготовление "золотых" конъюгатов на основе IgG млекопитающих хорошо проработано и широко используется в иммуноанализе. Однако установлено [4], что куриные IgY антитела обладают значительными отличиями от IgG по молекулярной массе, структуре и физико-химическим свойствам, способными повлиять как на эффективность их связывания с частицами золя золота, так и на стабильность проявителя. Известны примеры получения зондов на основе IgY и коллоидного золота для иммунохроматографических тестов [11]. В отличие от этих тестов, использующих крупные (40 нм) частицы золота, в дот-анализе с проявлением применяют более мелкодисперсные (20 нм) золи, что может влиять на эффективность их связывания с белками и стабильность полученного зонда [16].
Для оценки применимости IgY в дот-анализе с проявлением по отработанному ранее для IgG методу [13] изготовлены "золотые" зонды с использованием наиболее часто используемых вторичных иммунореагентов: бактериальных протеинов А и G, мышиных моноклональных (IgG) и куриных (IgY) антител к IgG человека и проведен эксперимент по сравнению их способности реагировать с иммуноглобулинами классов A, M и G человека.
Мышиные МКАТ ранее были выбраны в качестве реагента, обеспечивающего наибольшую чувствительность и специфичность теста [13]. В настоящем исследовании их использовали в качестве эталонного реагента сравнения. Параллельно выполняли эксперименты с пероксидазными конъюгатами на основе тех же иммуноглобулинов. В качестве определяемых аналитов использовали доступные коммерческие препараты афинно-очищенных иммуноглобулинов человека, которые разводили в 0,01 М карбонатном, рН 9,0 (для ИФА) и боратном, рН 6,0 (для дот-анализа) буферных растворах до начальной концентрации 400 нг/мл, из которой готовили серии двукратных разведений на тех же растворах. Полученные образцы сорбировали в планшетах (для ИФА) или на подложках из синтетической бумаги (для дот-анализа) и выполняли анализ так, как описано в разделе "Материал и методы". Положительным результатом считали значение, превышающее ОПкрит. За лимит определения принимали концентрацию аналита в конечном разведении, дающем положительный результат. Результаты оценки реактивности зондов с разными классами иммуноглобулинов человека приведены в табл. 1.
Приведенные в табл. 1 данные показывают, что все использованные зонды выявляют IgG человека с порогом обнаружения в диапазоне 25-12 нг/мл. Зонды с бактериальными протеинами А и G реагировали с IgМ и IgА в концентрации 50 и 200 нг/мл соответственно, что согласуется с ранее опубликованными данными [17]. Зонды с мышиными МКАТ IgG-a/Hum и куриными IgY-a/Hum не реагируют с IgМ и IgА человека, при этом пероксидазные и "золотые" конъюгаты имели одинаковую эффективность выявления IgG человека, а зонды с куриными антителами обнаруживали более низкие концентрации IgG (см. табл. 1).
На следующем этапе сравнивали зонды на основе моноклональных мышиных IgG-a/Hum и куриных IgY-a/Hum (как реагентов детекции, избирательно выявляющих иммуноглобулины класса G) при определении в образцах сыворотки крови человека IgG к ВКЭ. Проблемой серологической диагностики флавивирусов (ФВ) является выраженная перекрестная реактивность, поскольку гомология белков разных видов ФВ достигает 70-90% [18]. Для снижения перекрестных реакций в тест-системах для серодиагностики ФВ предпочтительно использование не цельных вирусов, а рекомбинантных антигенов [19, 20]. В проведенных модельных экспериментах в качестве реагента захвата использовали рекомбинантный аналог домена III оболочечного гликопротеина Е ВКЭ (EDIII-ВКЭ), содержащий наибольшее число видоспецифичных эпитопов [20, 21]. С использованием этого белка и зондов на основе IgG и IgY созданы экспериментальные наборы для выявления специфических IgG к ВКЭ методами ИФА и дот-анализа. С использованием этих наборов проведен сравнительный анализ панелей образцов сывороток крови пациентов: вакцинированных против КЭ; больных или переболевших КЭ и непривитых доноров; а также панели образцов, содержащих антитела к возбудителям других ФВ инфекций - вирусам желтой лихорадки и денге (табл. 2).
Исследование выполнено в сравнении с коммерческой тест-системой для выявления антител к ВКЭ "ВектоВКЭ-IgG" производства АО "Вектор-Бест". Результаты тестирования панельных образцов сывороток крови с использованием экспериментальных наборов представлены в табл. 3.
Из данных табл. 3 следует, что образцы панели, включающей отрицательные сыворотки доноров и положительные образцы от больных или перенесших заболевание КЭ пациентов, правильно определяются всеми использованными наборами. В панели образцов сыворотки крови от вакцинированных против ВКЭ набор "ВектоВКЭ-IgG" дал положительный результат со всеми сыворотками крови, в то время как экспериментальные наборы не выявляли антитела в 3 образцах этой панели. Такой результат может быть связан с высокой избирательностью эпитопов использованного в экспериментальных наборах антигена [20-22]. По результатам экспериментов была проведена оценка достоверности различий результатов определения положительных и отрицательных образцов коммерческим тестом и экспериментальными наборами. Для одной степени свободы и альфа-уровне теста 0,05 (5%) критическое значение критерия χ2 составил 3,841. Полученные значения от 1,05 до 0,084 ниже этого уровня, что не позволяет опровергнуть нулевую гипотезу об отсутствии различий между данными тестами.
При анализе панелей, содержащих антитела к гетерогенным ФВ набор "ВектоВКЭ-IgG" позитивно определяет 7 из 9 образцов с антителами к вирусу денге и 8 из 10 образцов, содержащих антитела к вирусу желтой лихорадки. Следует отметить, что отрицательные результаты в панели денге показали образцы, которые, согласно паспорту, содержат не IgG, а другие маркеры лихорадки денге. Ранее проведенные другими авторами исследования сывороток от пациентов, перенесших лихорадку денге, с использованием набора "ВектоВКЭ-IgG" показали, что этот набор положительно определяет образцы с высоким содержанием антител к вирусу лихорадки денге [23]. При формировании панели с антителами к вирусу желтой лихорадки образцы отбирали у пациентов с подтвержденным наличием специфических антител к вирусу желтой лихорадки [24], в анамнезе которых не было вакцинации или перенесенного КЭ. Следует отметить, что отрицательные результаты набор "ВектоВКЭ-IgG" показал с двумя сыворотками крови этой панели, имеющими минимальный уровень антител к вирусу желтой лихорадки. Все экспериментальные наборы показали отрицательный результат с образцами сывороток крови гетерогенных панелей, что согласуется с мнением других авторов [20, 22] о высокой специфичности использованного реагента захвата - рекомбинантного белка ЕDIII КЭ.
Чувствительность определения специфических антител использованными в предыдущем эксперименте наборами оценивали на двух положительных образцах из панели сывороток крови, содержащих антитела к ВКЭ. Готовили серии двукратных разведений указанных сывороток крови от 1:10 до 1:1280 на растворах для разведения образцов и выполняли тестирование в 5 параллелях с каждым набором. Результаты исследования приведены в табл. 4.
Из данных табл. 3 следует, что экспериментальные наборы с зондами на основе куриных антител формировали более интенсивный оптический сигнал по сравнению с конъюгатами мышиных IgG при удовлетворительной воспроизводимости анализа положительных образцов (коэффициент вариации только в отдельных случаях превышал 12%). Зонды с коллоидным золотом обеспечивали сходную с пероксидазными конъюгатами чувствительность выявления специфических антител, а зонды на основе куриных поликлональных антител демонстрировали преимущество в чувствительности перед зондами с мышиными МКАТ, что согласуется с данными ранее проведенных исследований [3, 7, 9]. Иммобилизованные на подложке в результате иммунной реакции "золотые" конъюгаты с мышиными и куриными антителами одинаково хорошо определялись при "золото-серебряном проявлении". Таким образом, связывание IgY с частицами золота не влияет на стабильность проявителя и эффективность проявления.
Заключение
Куриные IgY-a/Hum антитела могут быть успешно использованы для получения конъюгатов с пероксидазой и коллоидным золотом. Конъюгаты IgY с коллоидным золотом могут быть изготовлены по обычной технологии и не влияют на эффективность "золото-серебряного проявления". Чувствительность дот-иммуноанализа с применением конъюгата Au-IgY-a/Hum не уступает чувствительности ИФА с конъюгатами на основе мышиных и куриных антител. Использованный в экспериментах реагент захвата - рекомбинантный аналог домена III гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита обладает высокой специфичностью и позволяет дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к вирусам желтой лихорадки и денге. Полученные данные позволяют рассматривать антиген EDIII-ВКЭ и зонды на основе куриных антител, в качестве перспективных реагентов для разработки мультиплексного дот-иммуноанализа на плоских белковых матрицах.
[1] Аналит - компонент, искомый или определяемый в пробе вещества или материала объекта аналитического контроля. - Примеч. науч. ред.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nielsen U.B., Geierstanger B.H. Multiplexed sandwich assays in microarray format // J. Immunol. Methods. 2004. Vol. 290, N 1. P. 107-120. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.04.012
2. Wu R., Yakhkeshi S., Zhang X. Scientometric analysis and perspective of IgY technology study // Poult. Sci. 2022. Vol. 101, N 4. Article ID 101713. DOI: https://doi.org/10.1016/j.psj.2022.101713
3. Karachaliou C.E., Vassilakopoulou V., Livaniou E. IgY technology: methods for developing and evaluating avian immunoglobulins for the in vitro detection of biomolecules // World J. Methodol. 2021. Vol. 11, N 5. P. 243-262. DOI: https://doi.org/10.5662/wjm.v11.i5.243
4. Yakhkeshi S., Wu R., Chelliappan B., Zhang X. Trends in industrialization and commercialization of IgY technology // Front. Immunol. 2022. Vol. 13. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.991931
5. Amro W.A., Al-Qaisi W., Al-Razem F. Production and purification of IgY antibodies from chicken egg yolk // J. Genet. Eng. Biotechnol. 2018. Vol. 16, N 1. P. 99-103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.003
6. Lee L. Samardzic K., Wallach M., Frumkin L.R., Mochly-Rosen D. Immunoglobulin Y for potential diagnostic and therapeutic applications in infectious diseases // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.696003
7. Suresh L.G., Indhuprakash S.T., Gandhi S., Diraviyam T. Amalgamation of nanotechnology with chicken IgY to enrich therapeutic and diagnostic applications: a systematic review // Immunotherapy. 2023. Vol. 15, N 11. P. 867-884. DOI: https://doi.org/10.2217/imt-2022-0304
8. Sotiropoulou G., Pampalakis G., Prosnikli E., Evangelatos G.P., Livaniou E. Development and immunochemical evaluation of a novel chicken IgY antibody specific for KLK6 // Chem. Centr. J. 2012. Vol. 6, N 1. P. 148. DOI: https://doi.org/10.1186/1752-153X-6-148
9. Gasparyan V.K. Hen egg immunoglobulin Y in colloidal gold agglutination assay: comparison with rabbit immunoglobulin G // J. Clin. Lab. Anal. 2005. Vol. 19, N 3. P. 124-127. DOI: https://doi.org/10.1002/jcla.20065
10. Печелюлько А.А. и др. Сравнительный анализ эффективности использования антител кур и кроликов в конкурентном иммуноферментном методе определения коровьего β-казоморфина-7 // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55, № 6. C. 617-624. DOI: https://doi.org/10.1134/S0555109919060102
11. Печелюлько А.А. и др. Сравнительный анализ эффективности использования антител птиц и млекопитающих в сэндвич-методе определения HBsAg // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. Т. 53, № 1. C. 104-114. DOI: https://doi.org/10.7868/S055510991701013
12. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol. 22, N 12. P. 1084-1091. DOI: https://doi.org/10.1177/22.12.1084
13. Poltavchenko A.G. et al. The selection and optimization of the detection system for self-contained multiplexed dot-immunoassay // J. Immunoassay Immunochem. 2016. Vol. 37, N 5. P. 540-554. DOI: https://doi.org/10.1080/15321819.2016.1174134
14. Шаньшин Д.В. и др. Взаимодействие фрагментов оболочечного белка вируса зика с антителами сывороток людей, переболевших флавивирусными инфекциями // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 1. C. 73-82. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-AIO-805
15. Полтавченко А.Г. Ерш А.В., Филатов П.В., Баяндин Р.Б., Ушкаленко Н.Д. Разработка метода одновременного выявления серологических маркеров лихорадки денге // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 12, № 1. С. 75-83. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2023-12-1-75-83
16. Robinson N. Immunogold conjugation for IVD applications // IVD Technologies. 2002. Vol. 8, N 3. P. 33-36.
17. Bloom J.W., Wong M.F., Mitra G. Detection and reduction of Protein A contamination in immobilized Protein A purified monoclonal antibody preparations // J. Immunol. Methods. 1989. Vol. 117, N 1. P. 83-89. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(89)90121-X
18. Pulkkinen L.I.A., Barrass S.V., Domanska A., Överby A.K. et al. Molecular organisation of tick-borne encephalitis virus // Viruses. 2022. Vol. 14, N 4. P. 792. DOI: https://doi.org/10.3390/v14040792
19. Ludolfs D., Reinholz M., Schmitz H. Highly specific detection of antibodies to tick-borne encephalitis (TBE) virus in humans using a domain III antigen and a sensitive immune complex (IC) ELISA // J. Clin. Virol. 2009. Vol. 45, N 2. P. 125-128. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcv.2009.03.016
20. Барышникова В.С. и др. Рекомбинантный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита для создания дифференцирующей тест-системы // Биотехнология. 2022. Т. 38, № 6. C. 73-83. DOI: https://doi.org/10.56304/S0234275822060023
21. Holbrook M.R., Shope R.E., Barrett A.D. Use of recombinant E protein domain III-based enzyme-linked immunosorbent assays for differentiation of tick-borne encephalitis serocomplex flaviviruses from mosquito-borne flaviviruses // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42, N 9. P. 4101-4110. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.42.9.4101-4110.2004
22. Kuno G. Serodiagnosis of flaviviral infections and vaccinations in humans // Advances in Virus Research. Vol. 61. The Flaviviruses: Detection, Diagnosis, and Vaccine Development / eds. T.J. Chambers et al. Oxford : Academic Press, 2003. P. 3-65. DOI: https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)61001-8
23. Терновой В.А. и др. Выявление маркеров лихорадки денге у пациентов после посещения эндемичных по денге стран // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019. Т. 37, № 3. C. 140-148. DOI: https://doi.org/10.17116/molgen201937031140
24. Кривошеина Е.И., Карташов М.Ю., Найденова Е.В., Ушкаленко Н.Д. и др. Разработка способа выявления специфических антител к белку Е вируса желтой лихорадки (Flaviviridae: Flavivirus) методом иммуноферментного анализа // Вопросы вирусологии. 2022. Т. 67, № 4. C. 341-350. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-123