Оценка эффективности применения конъюгатов куриных IgY антител к IgG человека в иммуноферментном анализе и дот-иммуноанализе

• Полтавченко Александр Георгиевич
• Ерш Анна Васильевна
• Ушкаленко Никита Дмитриевич
• Филатов Павел Владимирович
• Колосова Евгения Андреевна
• Шаньшин Даниил Васильевич
• Щербаков Дмитрий Николаевич

Резюме

Цель работы - сравнительная оценка куриных (IgY) и мышиных моноклональных (IgG) антител к IgG человека в качестве зонда для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа при диагностике клещевого энцефалита.

Материал и методы. Проведены эксперименты по сравнению способности зондов на основе мышиных IgG и куриных IgY антител к IgG человека, а также протеинов А и G, связанных с пероксидазой хрена и коллоидным золотом, определять человеческие иммуноглобулины разных классов, а также выявлять в сыворотке крови человека IgG, специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ). В качестве реагента захвата в ИФА и дот-анализе использовали рекомбинантный аналог домена III гликопротеина Е ВКЭ. Исследования выполнены в сравнении с коммерческим набором "ВектоВКЭ-IgG" с применением панелей сывороток крови, содержащих антитела к ВКЭ, желтой лихорадке и денге, а также образцов от здоровых доноров.

Результаты и обсуждение. Показано, что сконструированные экспериментальные наборы для ИФА и дот-анализа адекватно определяют положительные и отрицательные образцы и позволяют дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к другим флавивирусам. Зонды с пероксидазой и коллоидным золотом обеспечивают одинаковые лимиты обнаружения IgG, а зонды на основе куриных антител демонстрируют более интенсивные оптические сигналы и преимущества в чувствительности по сравнению с конъюгатами мышиных IgG.

Заключение. Полученные данные позволяют рассматривать конъюгаты на основе куриных антител в качестве перспективных реагентов для иммуноанализа.

Ключевые слова:IgY; IgG; клещевой энцефалит; конъюгаты; иммунодиагностика; дот-иммуноанализ; иммуноферментный анализ

Выбор эффективного иммунореагента детекции - белка, используемого для изготовления зонда (конъюгата с легко выявляемой меткой), является важным этапом при создании иммунохимического теста, поскольку от правильного выбора во многом зависит успешность анализа. В серологических тестах при выявлении антител в качестве детекторных белков используют вторичные иммунореагенты - моно- и поликлональные антитела к выявляемым иммуноглобулинам или белки, связывающиеся с константными фрагментами (Fc) антител: протеин А из Staphylococcus aureus (SpA) и протеин G, выделяемый из стрептококков (SpG). Их качество зависит от способа получения и хранения [1] и может значительно различаться в продуктах из разных источников. Выбор наиболее подходящего компонента, как правило, проводят на основе сравнительных экспериментов. Критериями выбора служат чувствительность и специфичность выявления целевого аналита, эффективность связывания с меткой, а также доступность и стоимость детекторного белка. В последнее время значительный интерес вызывают выделяемые из желтка куриных яиц антитела IgY как альтернатива антителам млекопитающих [2]. Интерес к использованию IgY-технологии объясняется биоэтическими преимуществами [3], возможностью получения большого количества высокоактивных и специфичных антител с относительно низкими затратами [4], простотой и эффективностью выделения IgY из яиц [5], легкостью масштабирования производства антител в широком диапазоне [4], а также уникальными свойствами куриных антител, что определяет их успешное применение с диагностическими и иммунотерапевтическими целями [2, 4, 6, 7].

Подобно IgG млекопитающих, IgY состоит из двух тяжелых (H) и двух легких (L) полипептидных цепей, которые организованы в Y-образную характерную "единицу" и содержат 2 идентичных активных центра связывания антигена. Однако структура и физико-химические характеристики IgY отличаются от IgG, что приводит к различиям в их свойствах и оказывает значительное влияние на стабильность, иммуногенность и биологическую активность [3, 6]. Известны примеры получения и эффективного применения зондов на основе антивидовых и специфичных к отдельным белкам IgY антител, связанных с пероксидазой [3, 8], коллоидным золотом [7, 9] и другими метками [7, 10]. Большинство полученных данных свидетельствует о том, что применение куриных антител в иммуноанализе способствует повышению чувствительности и минимизации ложных сигналов. В то же время некоторые авторы приводят случаи слабой иммунореактивности организма кур и низкой аффинности полученных антител при иммунизации некоторыми антигенами [10]. Отмечают низкую эффективность IgY в тестах иммунопреципитации [8], меньшую чувствительность тест-систем на основе IgY по сравнению с тестами на основе IgG [11] и делают выводы о необходимости при создании методов с использованием желточных иммуноглобулинов проводить сравнения с методами, в которых используются иммуноглобулины млекопитающих [10].

Цель работы - сравнительная оценка куриных (IgY) и мышиных моноклональных (IgG) антител к IgG человека в качестве зонда для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа при диагностике клещевого энцефалита.

Материал и методы

Проведено сравнительное экспериментальное исследование по оценке эффективности выявления в образцах сывороток крови специфических антител к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) с использованием экспериментальных наборов реагентов для проведения ИФА и дот-иммуноанализа.

Иммунореагенты

Реагенты захвата - мышиные моноклональные антитела (МКАТ) к IgG человека (I4506), бактериальные белок А (P6031) и белок G (O8062) производства Sigma-Aldrich (США).

Аналиты - антитела IgМ человека (H Imm), IgА человека (Н Iаа), IgG человека (H Igg) производства "Имтек" (Россия).

Получение поликлональных антител IgY курицы к IgG человека и конъюгатов с пероксидазой хрена

Кур иммунизировали препаратом Иммуноглобулин человека нормальный (НПО "Микроген", Россия), смешанным в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (Sigma-Aldrich, США), в дозе 500 мкг/животное. Препарат (100 мкг/мл) вводили внутримышечно в грудные мышцы птицы. Иммунизацию повторяли на 10, 22, 32, 44, 56 и 68‑е сутки, используя неполный адъювант Фрейнда. Собранные от иммунизированных кур яйца хранили при 4 °С. Выделение антител из яиц проводили по ранее описанному способу [5]. Получение конъюгатов пероксидазы хрена с поликлональными куриными IgY (HRP-Chicken IgY-a/Hum) и моноклональными мышиными IgG (HRP-Mouse IgG-a/Hum) проводили по методу Nakano и Kawaoi [12].

Получение зондов с коллоидным золотом

Определение дозы нагрузки и связывание золя золота (20 нм) с детекторными белками выполняли по ранее описанной методике [13]. Таким способом получены зонды коллоидного золота с протеином А (Au-SpA), протеином G (Au-SpG), МКАТ мыши к IgG человека (Au-Mouse IgG-a/Hum) и куриными антителами к IgG человека (Au-Chicken IgY-a/Hum).

Получение рекомбинантного аналога домена III гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита

Синтез гена, кодирующего фрагмент оболочного белка E вируса КЭ, соответствующий домену III (EDIII-ВКЭ) штамма Glubinnoe/2004 [GenBank: DQ862460.1], выполняли в OOO "ДНК-Синтез" (Россия). Наработку, выделение и очистку белка проводили аналогично методике, приведенной в предыдущей работе [14].

В работе использовали: тетрахлорзолотую кислоту [ТХЗК (HAuCl₄)], лимонную кислоту, твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), thimerosal, казеин и натрия азид (Sigma-Aldrich, США); другие химические реактивы отечественного производства с квалификацией не ниже "ч.д.а." ("чистый для анализа". - Примеч. ред.). Для изготовления подложки иммуночипов применяли синтетический материал на основе ПВХ Zenofol Print ("Зенон", Россия).

Образцы сывороток крови

В экспериментах использовали пул сывороток крови человека, содержащий:

· панель I из 20 образцов сывороток крови сотрудников ГНЦ ВБ "Вектор", привитых против клещевого энцефалита (КЭ). Отбор и использование сывороток крови одобрены на заседании этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора № 6 от 18.04.2023 и проведены в соответствии с информированным согласием;

· панель II - панель образцов, содержащих и не содержащих антитела к ВКЭ, включающую 20 серопозитивных сывороток крови больных или переболевших клещевым энцефалитом и 15 серонегативных образцов сывороток крови доноров, которые были предоставлены ООО "Имбиан-Лаб" (Россия);

· панель III, включающую 10 сывороток крови, полученных от сотрудников ГНЦ ВБ "Вектор", вакцинированных против желтой лихорадки. Участие в исследовании одобрено на заседании этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнад­зора № 4 от 14.04.2022 и проведено в соответствии с их информированным согласием;

· панель IV - верификационная панель для лихорадки денге, состоящая из 9 образцов сыворотки крови, содержащих антитела к вирусу денге (Dengue Fever Verification panel, KZMC028), производства ZeptoMetrix^®, LLC (США).

При проведении экспериментов все образцы подвергались кодированию.

Иммуноферментный анализ

Определяемые аналиты (IgA, IgM и IgG) разводили в 0,01 М карбонатном буферном растворе (рН 9,4) до концентрации 400 нг/мл, из которой готовили серии двукратных разведений от 400 до 3 нг/мл и выполняли их иммобилизацию в высокосорбционных планшетах Nest (Китай) в течение 20 ч, при температуре +4 ^оС из объема 100 мкл. Рекомбинантный белок ЕDIII-ВКЭ с концентрацией 1 мкг/мл сорбировали в ячейках планшета таким же образом. ИФА выполняли по стандартной методике [14]. Результаты учитывали спектрофотометрически - оптическая плотность при длине волны 450 нм (ОП₄₅₀).

Дот-иммуноанализ

В экспериментальных наборах дот-иммуноанализа твердой фазой являлась подложка из синтетической бумаги, на рабочую сторону которой дискретно каплями по 2,5 мкл наносили двукратные разведения аналитов (от 400 до 3 нг/мл) или белок ЕDIII-КЭ (2,6 мкг/мл) в 0,01 М боратном буферном растворе (рН 6,0). В качестве контроля работоспособности конъюгата на подложку наносили IgG человека в концентрации 2,5 мкг/мл в том же буферном растворе. Подложки инкубировали 12 ч при 4 °С и высушивали при 40 °С в течение 2 ч. Блокировку свободных от антигенов участков поверхности осуществляли 0,2% раствором казеина на 0,01 М фосфатном буферном растворе (рН 7,2) в течение 2 ч при комнатной температуре. Дальнейшую подготовку подложек и выполнение анализа проводили по ранее приведенной методике [15].

При учете результатов изображение матриц оцифровывали с помощью планшетного сканера и обрабатывали с использованием специальной компьютерной программы, оценивающей интенсивность окраски на местах нанесения соответствующих иммунореагентов в относительных единицах светопоглощения. За положительный результат принимали значение, превышающее отсекаемые значения оптической плотности отрицательного результата (ОП_крит).

Контрольная тест-система

Сравнительные эксперименты по оценке эффективности выявления в образцах сывороток крови специфических антител к ВКЭ выполняли с использованием коммерческого набора реагентов для иммуноферментного выявления и количественного определения IgG к ВКЭ ВектоВКЭ-IgG (D-1156) РУ № РЗН 2017/5605 от 04.2017 АО "Вектор-Бест".

Статистическая обработка

Все эксперименты выполняли в 5 повторах. При статистической обработке полученных данных с помощью программного продукта Microsoft Excel вычисляли: среднее (M), стандартное отклонение σ, доверительный интервал (±∆х) для вероятности 95% (р=0,95, α=0,05), коэффициент вариации (V). Отсекаемые значения (ОП_крит) для каждого вида анализа высчитывали как M+∆х по всему пулу отрицательных донорских сывороток крови. Диагностические чувствительность и специфичность теста оценивали по ГОСТ Р 53022.3-2008. Достоверность различий результатов, полученных с применением экспериментальных тестов и теста сравнения, оценивали путем расчета критерия χ² по методике Макнемара с использованием онлайн-ресурса https://medstatistic.ru/index.php. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Описанные ниже исследования проведены в рамках проекта по созданию автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям клещевых инфекций - клещевого энцефалита, боррелиоза, риккетсиоза и др. Мультиплексный дот-иммуноанализ антител выполняется на плоских плотных подложках с дискретно нанесенными в определенном порядке антигенами возбудителей инфекционных заболеваний. При выполнении анализа матрицу последовательно инкубируют с исследуемым образцом крови и зондом - вторичным иммунореагентом, связанным с коллоидным золотом. Частицы золота, иммобилизованные на подложке за счет иммунного связывания, проявляют в кислом растворе, содержащем растворимую соль серебра и восстановитель (метол, гидрохинон и др.). Серебро из такого нестабильного раствора способно каталитически восстанавливаться на частицах золота. Учет результатов анализа основан на обнаружении темной окраски восстановленного серебра в определенных зонах на подложке [13].

В качестве иммунореагентов детекции используют вторичные антитела от разных животных, направленные против антител человека, или бактериальные протеины А и G, способные связываться с константной частью (Fc-фрагмент) антител человека и некоторых животных. Эффективность таких конъюгатов зависит от качества реагентов детекции, успешности процедуры связывания этих реагентов с поверхностью частиц коллоидного золота и способности этих частиц восстанавливать серебро, не дестабилизируя проявитель. Изготовление "золотых" конъюгатов на основе IgG млекопитающих хорошо проработано и широко используется в иммуноанализе. Однако установлено [4], что куриные IgY антитела обладают значительными отличиями от IgG по молекулярной массе, структуре и физико-химическим свойствам, способными повлиять как на эффективность их связывания с частицами золя золота, так и на стабильность проявителя. Известны примеры получения зондов на основе IgY и коллоидного золота для иммунохроматографических тестов [11]. В отличие от этих тестов, использующих крупные (40 нм) частицы золота, в дот-анализе с проявлением применяют более мелкодисперсные (20 нм) золи, что может влиять на эффективность их связывания с белками и стабильность полученного зонда [16].

Для оценки применимости IgY в дот-анализе с проявлением по отработанному ранее для IgG методу [13] изготовлены "золотые" зонды с использованием наиболее часто используемых вторичных иммунореагентов: бактериальных протеинов А и G, мышиных моноклональных (IgG) и куриных (IgY) антител к IgG человека и проведен эксперимент по сравнению их способности реагировать с иммуноглобулинами классов A, M и G человека.

Мышиные МКАТ ранее были выбраны в качестве реагента, обеспечивающего наибольшую чувствительность и специфичность теста [13]. В настоящем исследовании их использовали в качестве эталонного реагента сравнения. Параллельно выполняли эксперименты с пероксидазными конъюгатами на основе тех же иммуноглобулинов. В качестве определяемых аналитов использовали доступные коммерческие препараты афинно-очищенных иммуноглобулинов человека, которые разводили в 0,01 М карбонатном, рН 9,0 (для ИФА) и боратном, рН 6,0 (для дот-анализа) буферных растворах до начальной концентрации 400 нг/мл, из которой готовили серии двукратных разведений на тех же растворах. Полученные образцы сорбировали в планшетах (для ИФА) или на подложках из синтетической бумаги (для дот-анализа) и выполняли анализ так, как описано в разделе "Материал и методы". Положительным результатом считали значение, превышающее ОП_крит. За лимит определения принимали концентрацию аналита в конечном разведении, дающем положительный результат. Результаты оценки реактивности зондов с разными классами иммуноглобулинов человека приведены в табл. 1.

Приведенные в табл. 1 данные показывают, что все использованные зонды выявляют IgG человека с порогом обнаружения в диапазоне 25-12 нг/мл. Зонды с бактериальными протеинами А и G реагировали с IgМ и IgА в концентрации 50 и 200 нг/мл соответственно, что согласуется с ранее опубликованными данными [17]. Зонды с мышиными МКАТ IgG-a/Hum и куриными IgY-a/Hum не реагируют с IgМ и IgА человека, при этом пероксидазные и "золотые" конъюгаты имели одинаковую эффективность выявления IgG человека, а зонды с куриными антителами обнаруживали более низкие концентрации IgG (см. табл. 1).

На следующем этапе сравнивали зонды на основе моноклональных мышиных IgG-a/Hum и куриных IgY-a/Hum (как реагентов детекции, избирательно выявляющих иммуноглобулины класса G) при определении в образцах сыворотки крови человека IgG к ВКЭ. Проблемой серологической диагностики флавивирусов (ФВ) является выраженная перекрестная реактивность, поскольку гомология белков разных видов ФВ достигает 70-90% [18]. Для снижения перекрестных реакций в тест-системах для серодиагностики ФВ предпочтительно использование не цельных вирусов, а рекомбинантных антигенов [19, 20]. В проведенных модельных экспериментах в качестве реагента захвата использовали рекомбинантный аналог домена III оболочечного гликопротеина Е ВКЭ (EDIII-ВКЭ), содержащий наибольшее число видоспецифичных эпитопов [20, 21]. С использованием этого белка и зондов на основе IgG и IgY созданы экспериментальные наборы для выявления специфических IgG к ВКЭ методами ИФА и дот-анализа. С использованием этих наборов проведен сравнительный анализ панелей образцов сывороток крови пациентов: вакцинированных против КЭ; больных или переболевших КЭ и непривитых доноров; а также панели образцов, содержащих антитела к возбудителям других ФВ инфекций - вирусам желтой лихорадки и денге (табл. 2).

Исследование выполнено в сравнении с коммерческой тест-системой для выявления антител к ВКЭ "ВектоВКЭ-IgG" производства АО "Вектор-Бест". Результаты тестирования панельных образцов сывороток крови с использованием экспериментальных наборов представлены в табл. 3.

Из данных табл. 3 следует, что образцы панели, включающей отрицательные сыворотки доноров и положительные образцы от больных или перенесших заболевание КЭ пациентов, правильно определяются всеми использованными наборами. В панели образцов сыворотки крови от вакцинированных против ВКЭ набор "ВектоВКЭ-IgG" дал положительный результат со всеми сыворотками крови, в то время как экспериментальные наборы не выявляли антитела в 3 образцах этой панели. Такой результат может быть связан с высокой избирательностью эпитопов использованного в экспериментальных наборах антигена [20-22]. По результатам экспериментов была проведена оценка достоверности различий результатов определения положительных и отрицательных образцов коммерческим тестом и экспериментальными наборами. Для одной степени свободы и альфа-уровне теста 0,05 (5%) критическое значение критерия χ² составил 3,841. Полученные значения от 1,05 до 0,084 ниже этого уровня, что не позволяет опровергнуть нулевую гипотезу об отсутствии различий между данными тестами.

При анализе панелей, содержащих антитела к гетерогенным ФВ набор "ВектоВКЭ-IgG" позитивно определяет 7 из 9 образцов с антителами к вирусу денге и 8 из 10 образцов, содержащих антитела к вирусу желтой лихорадки. Следует отметить, что отрицательные результаты в панели денге показали образцы, которые, согласно паспорту, содержат не IgG, а другие маркеры лихорадки денге. Ранее проведенные другими авторами исследования сывороток от пациентов, перенесших лихорадку денге, с использованием набора "ВектоВКЭ-IgG" показали, что этот набор положительно определяет образцы с высоким содержанием антител к вирусу лихорадки денге [23]. При формировании панели с антителами к вирусу желтой лихорадки образцы отбирали у пациентов с подтвержденным наличием специфических антител к вирусу желтой лихорадки [24], в анамнезе которых не было вакцинации или перенесенного КЭ. Следует отметить, что отрицательные результаты набор "ВектоВКЭ-IgG" показал с двумя сыворотками крови этой панели, имеющими минимальный уровень антител к вирусу желтой лихорадки. Все экспериментальные наборы показали отрицательный результат с образцами сывороток крови гетерогенных панелей, что согласуется с мнением других авторов [20, 22] о высокой специфичности использованного реагента захвата - рекомбинантного белка ЕDIII КЭ.

Чувствительность определения специфических антител использованными в предыдущем эксперименте наборами оценивали на двух положительных образцах из панели сывороток крови, содержащих антитела к ВКЭ. Готовили серии двукратных разведений указанных сывороток крови от 1:10 до 1:1280 на растворах для разведения образцов и выполняли тестирование в 5 параллелях с каждым набором. Результаты исследования приведены в табл. 4.

Из данных табл. 3 следует, что экспериментальные наборы с зондами на основе куриных антител формировали более интенсивный оптический сигнал по сравнению с конъюгатами мышиных IgG при удовлетворительной воспроизводимости анализа положительных образцов (коэффициент вариации только в отдельных случаях превышал 12%). Зонды с коллоидным золотом обеспечивали сходную с пероксидазными конъюгатами чувствительность выявления специфических антител, а зонды на основе куриных поликлональных антител демонстрировали преимущество в чувствительности перед зондами с мышиными МКАТ, что согласуется с данными ранее проведенных исследований [3, 7, 9]. Иммобилизованные на подложке в результате иммунной реакции "золотые" конъюгаты с мышиными и куриными антителами одинаково хорошо определялись при "золото-серебряном проявлении". Таким образом, связывание IgY с частицами золота не влияет на стабильность проявителя и эффективность проявления.

Заключение

Куриные IgY-a/Hum антитела могут быть успешно использованы для получения конъюгатов с пероксидазой и коллоидным золотом. Конъюгаты IgY с коллоидным золотом могут быть изготовлены по обычной технологии и не влияют на эффективность "золото-серебряного проявления". Чувствительность дот-иммуноанализа с применением конъюгата Au-IgY-a/Hum не уступает чувствительности ИФА с конъюгатами на основе мышиных и куриных антител. Использованный в экспериментах реагент захвата - рекомбинантный аналог домена III гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита обладает высокой специфичностью и позволяет дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к вирусам желтой лихорадки и денге. Полученные данные позволяют рассматривать антиген EDIII-ВКЭ и зонды на основе куриных антител, в качестве перспективных реагентов для разработки мультиплексного дот-иммуноанализа на плоских белковых матрицах.

^[1] Аналит - компонент, искомый или определяемый в пробе вещества или материала объекта аналитического контроля. - Примеч. науч. ред.

ЛИТЕРАТУРА

1. Nielsen U.B., Geierstanger B.H. Multiplexed sandwich assays in microarray format // J. Immunol. Methods. 2004. Vol. 290, N 1. P. 107-120. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.04.012

2. Wu R., Yakhkeshi S., Zhang X. Scientometric analysis and perspective of IgY technology study // Poult. Sci. 2022. Vol. 101, N 4. Article ID 101713. DOI: https://doi.org/10.1016/j.psj.2022.101713

3. Karachaliou C.E., Vassilakopoulou V., Livaniou E. IgY technology: methods for developing and evaluating avian immunoglobulins for the in vitro detection of biomolecules // World J. Methodol. 2021. Vol. 11, N 5. P. 243-262. DOI: https://doi.org/10.5662/wjm.v11.i5.243

4. Yakhkeshi S., Wu R., Chelliappan B., Zhang X. Trends in industrialization and commercialization of IgY technology // Front. Immunol. 2022. Vol. 13. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.991931

5. Amro W.A., Al-Qaisi W., Al-Razem F. Production and purification of IgY antibodies from chicken egg yolk // J. Genet. Eng. Biotechnol. 2018. Vol. 16, N 1. P. 99-103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.003

6. Lee L. Samardzic K., Wallach M., Frumkin L.R., Mochly-Rosen D. Immunoglobulin Y for potential diagnostic and therapeutic applications in infectious diseases // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.696003

7. Suresh L.G., Indhuprakash S.T., Gandhi S., Diraviyam T. Amalgamation of nanotechnology with chicken IgY to enrich therapeutic and diagnostic applications: a systematic review // Immunotherapy. 2023. Vol. 15, N 11. P. 867-884. DOI: https://doi.org/10.2217/imt-2022-0304

8. Sotiropoulou G., Pampalakis G., Prosnikli E., Evangelatos G.P., Livaniou E. Development and immunochemical evaluation of a novel chicken IgY antibody specific for KLK6 // Chem. Centr. J. 2012. Vol. 6, N 1. P. 148. DOI: https://doi.org/10.1186/1752-153X-6-148

9. Gasparyan V.K. Hen egg immunoglobulin Y in colloidal gold agglutination assay: comparison with rabbit immunoglobulin G // J. Clin. Lab. Anal. 2005. Vol. 19, N 3. P. 124-127. DOI: https://doi.org/10.1002/jcla.20065

10. Печелюлько А.А. и др. Сравнительный анализ эффективности использования антител кур и кроликов в конкурентном иммуноферментном методе определения коровьего β-казоморфина-7 // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55, № 6. C. 617-624. DOI: https://doi.org/10.1134/S0555109919060102

11. Печелюлько А.А. и др. Сравнительный анализ эффективности использования антител птиц и млекопитающих в сэндвич-методе определения HBsAg // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. Т. 53, № 1. C. 104-114. DOI: https://doi.org/10.7868/S055510991701013

12. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol. 22, N 12. P. 1084-1091. DOI: https://doi.org/10.1177/22.12.1084

13. Poltavchenko A.G. et al. The selection and optimization of the detection system for self-contained multiplexed dot-immunoassay // J. Immunoassay Immunochem. 2016. Vol. 37, N 5. P. 540-554. DOI: https://doi.org/10.1080/15321819.2016.1174134

14. Шаньшин Д.В. и др. Взаимодействие фрагментов оболочечного белка вируса зика с антителами сывороток людей, переболевших флавивирусными инфекциями // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 1. C. 73-82. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-AIO-805

15. Полтавченко А.Г. Ерш А.В., Филатов П.В., Баяндин Р.Б., Ушкаленко Н.Д. Разработка метода одновременного выявления серологических маркеров лихорадки денге // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 12, № 1. С. 75-83. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2023-12-1-75-83

16. Robinson N. Immunogold conjugation for IVD applications // IVD Technologies. 2002. Vol. 8, N 3. P. 33-36.

17. Bloom J.W., Wong M.F., Mitra G. Detection and reduction of Protein A contamination in immobilized Protein A purified monoclonal antibody preparations // J. Immunol. Methods. 1989. Vol. 117, N 1. P. 83-89. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(89)90121-X

18. Pulkkinen L.I.A., Barrass S.V., Domanska A., Överby A.K. et al. Molecular organisation of tick-borne encephalitis virus // Viruses. 2022. Vol. 14, N 4. P. 792. DOI: https://doi.org/10.3390/v14040792

19. Ludolfs D., Reinholz M., Schmitz H. Highly specific detection of antibodies to tick-borne encephalitis (TBE) virus in humans using a domain III antigen and a sensitive immune complex (IC) ELISA // J. Clin. Virol. 2009. Vol. 45, N 2. P. 125-128. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcv.2009.03.016

20. Барышникова В.С. и др. Рекомбинантный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита для создания дифференцирующей тест-системы // Биотехнология. 2022. Т. 38, № 6. C. 73-83. DOI: https://doi.org/10.56304/S0234275822060023

21. Holbrook M.R., Shope R.E., Barrett A.D. Use of recombinant E protein domain III-based enzyme-linked immunosorbent assays for differentiation of tick-borne encephalitis serocomplex flaviviruses from mosquito-borne flaviviruses // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42, N 9. P. 4101-4110. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.42.9.4101-4110.2004

22. Kuno G. Serodiagnosis of flaviviral infections and vaccinations in humans // Advances in Virus Research. Vol. 61. The Flaviviruses: Detection, Diagnosis, and Vaccine Development / eds. T.J. Chambers et al. Oxford : Academic Press, 2003. P. 3-65. DOI: https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)61001-8

23. Терновой В.А. и др. Выявление маркеров лихорадки денге у пациентов после посещения эндемичных по денге стран // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019. Т. 37, № 3. C. 140-148. DOI: https://doi.org/10.17116/molgen201937031140

24. Кривошеина Е.И., Карташов М.Ю., Найденова Е.В., Ушкаленко Н.Д. и др. Разработка способа выявления специфических антител к белку Е вируса желтой лихорадки (Flaviviridae: Flavivirus) методом иммуноферментного анализа // Вопросы вирусологии. 2022. Т. 67, № 4. C. 341-350. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-123

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)