Пути совершенствования освоения лабораторной диагностики туляремии на курсах дополнительного профессионального образования

Резюме

При подготовке специалистов различного профиля (бактериологов, генетиков, иммунологов, эпидемиологов), участвующих в проведении диагностических и экспериментальных исследований с материалом, подозрительным на зараженность или зараженным бактериями, относящимися к I-II группам патогенности, традиционно используют вирулентные штаммы Francisella tularensis. Однако основное направление государственной политики в области обеспечения биобезопасности РФ - исключение или максимальное снижение использования в технологических процессах патогенных микроорганизмов. Учитывая данный подход, приоритетной задачей является проведение научных исследований по замене вирулентных штаммов туляремийного микроба на вакцинные, аттенуированные или со сниженной вирулентностью.

Цель исследования - разработка критериев подбора штаммов F. tularensis в качестве учебных, принципа формирования и применения набора штаммов для освоения методов лабораторной диагностики туляремии.

Материал и методы. В качестве материалов использовали законодательные и подзаконные акты; нормативно-методические документы (методические указания, санитарные правила) и научные публикации в области лабораторной диагностики туляремии и обеспечения биобезопасности работ с патогенными биологическими агентами (ПБА); открытые научно-технические источники информации; программы дополнительного профессионального образования (профессиональной переподготовки и повышения квалификации) специалистов для работ с возбудителями особо опасных инфекций (ООИ) и повышения квалификации. Метод исследования: аналитический.

Результаты и обсуждение. Определены критерии подбора штаммов возбудителя туляремии для освоения методов лабораторной диагностики в рамках учебного модуля "Микробиология и лабораторный диагноз туляремии" и разработан дифференцированный подход к их применению с целью снижения вероятности лабораторного инфицирования обучающихся.

Заключение. Обоснована необходимость формирования учебного набора штаммов F. tularensis. Разработаны критерии отбора штаммов в качестве кандидатов в учебные - штаммы со сниженной вирулентностью, вакцинные и аттенуированные, которые позволят снизить вероятность лабораторного инфицирования слушателей курсов при освоении методов лабораторной диагностики туляремии.

Ключевые слова:Francisella tularensis, биологическая безопасность, подготовка специалистов, учебные штаммы

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии финансовой поддержки при написании статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Сазанова Е.В., Попов Ю.А.; сбор и обработка материала - Сазанова Е.В.; написание текста - Сазанова Е.В., Осина Н.А.; редактирование - Горельникова Е.А.

Для цитирования: Сазанова Е.В., Осина Н.А., Горельникова Е.А., Попов Ю.А. Пути совершенствования освоения лабораторной диагностики туляремии на курсах дополнительного профессионального образования // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 9, № 3. С. 133-138. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2020-9-3-133-138

Основной целью дополнительного профессионального образования (ДПО) является формирование специалиста, владеющего ключевыми профессиональными компетенциями, позволяющими осуществлять лабораторную диагностику туляремии.

В результате обучения слушатели должны приобрести базовые знания, используемые при проведении лабораторных исследований на туляремию, умение идентифицировать выделенные культуры по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным, молекулярно-генетическим свойствам и навыки постановки микробиологических тестов, методы работы с лабораторными животными. Однако в Указе Президента РФ от 11.03.2019 № 97 обозначена одна из задач о необходимости максимальной замены в технологических процессах патогенных микроорганизмов на безопасные [1].

В связи с вышеизложенным обучение слушателей курсов тематического усовершенствования методам безопасной работы с возбудителями особо опасных бактериальных инфекций по программам ДПО в противочумных учреждениях Роспотребнадзора необходимо проводить, учитывая профессиональные требования к уровню подготовки и актуальные направления государственной политики.

Для реализации поставленной цели сотрудниками отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора ранее были созданы наборы авирулентных штаммов, используемые при освоении учебных модулей "Микробиология и лабораторная диагностика холеры" и "Микробиология и лабораторная диагностика чумы" [2]. Это позволило решить важную практическую задачу обеспечения биологической безопасности - снизить вероятность лабораторного инфицирования обучающихся, минимизировав применение вирулентных штаммов. Вместе с тем необходимо продолжить работу по методическому обеспечению учебного модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии", обязательного при подготовке специалистов по особо опасным инфекциям (ООИ).

Согласно национальной классификации микроорганизмов, действующей на территории РФ, возбудитель туляремии относят ко II группе патогенности (опасности) [3]. F. tularensis по вероятности использования в качестве биологического оружия включена в I группу [4, 5]. Кроме того, возбудитель туляремии внесен в Список микроорганизмов, токсинов, оборудования и технологий, подлежащих экспортному контролю [6].

Природные очаги этой инфекции расположены на территории различных стран, в том числе широко распространены в Российской Федерации; устойчивы территориально, но могут трансформироваться в результате хозяйственной деятельности человека. Характеризуются динамической эпизоотической активностью и наличием эпидемических проявлений [7].

Проведение лабораторной диагностики туляремии требует грамотных действий специалистов. Одно из условий, предъявляемое к ним, - прохождение специализированных курсов с освоением методов безопасной работы и последующее повышение профессиональных компетенций [3, 8].

Согласно международной классификации, вид F. tularensis представлен 4 подвидами - F. tularensis subsp. tularensis (nearctica), F. tularensis subsp. holarctica (palearctica), F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. novicida.

Штаммы разных подвидов туляремийного микроба имеют высокую гомологию антигенной структуры и нуклеотидной последовательности генома, но, несмотря на это, они отличаются по вирулентности и географическому распространению [9-11]. Основываясь на данных анализа гомологии геномов возбудителя туляремии различного происхождения, выявлены области RD (region of difference, область различий), которые в разной степени делетированы у подвидов возбудителя [12]. Исключением является область RD1, содержащая делеции у F. tularensis holarctica, mediasiatica, нуклеотидные замены у F. tularensis novicida и интактная у F. tularensis tularensis [12]. Специалистами ВОЗ предложено использовать анализ вариабельности RD1 для подвидовой дифференциации туляремийного микроба [13]. Опубликованы сообщения о выделении на территории России подвида mediasiatica, циркуляция которого ранее наблюдалась только в природных очагах Средней Азии [14]. Также имеются данные о выделении на территории Европы высоковирулентных штаммов F. tularensis subsp. tularensis, распространенных ранее исключительно только в Северной Америке [15]. Поэтому важно подобрать штаммы F. tularensis для изучения слушателями курсов биологических свойств всех подвидов.

Сотрудники ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора проводят обучение с учетом современных требований, предъявляемых к профессиональной деятельности специалистов при лабораторной диагностике туляремии [16, 17]. В настоящее время в процессе освоения диагностических методов используют единственный безопасный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, относящийся к III группе патогенности, применяемый для вакцинации людей [3]. Вместе с тем данный штамм позволяет изучать биологические свойства только F. tularensis подвида holarctica и не дает возможности продемонстрировать весь спектр типичных биологических свойств иных подвидов, а также освоить комплекс базовых методов индикации и идентификации [18]. Поэтому на практических занятиях используют также вирулентные штаммы II группы патогенности, в том числе F. tularensis 503/840, относящийся к подвиду holarctica, LD50 которого для белых мышей при подкожном методе заражения составляет 5 КОЕ. Данный штамм позволяет эффективно освоить биологический метод исследования, который является обязательным в схеме диагностики, вызывая в организме биопробных лабораторных животных картину острого сепсиса со значительным накоплением бактерий в органах и тканях. При посеве тканей паренхиматозных органов на питательные среды отмечают стабильное выделение возбудителя. Однако при возникновении аварийных ситуаций штамм потенциально опасен в плане риска инфицирования обучающихся, что обусловливает необходимость его замены авирулентными или менее вирулентными.

Подбор штаммов в рамках программ (ДПО) определяет преподаватель с учетом действующих нормативно-методических документов по лабораторной диагностике туляремии и в соответствии с тематическим планом образовательного модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии", разработанного специалистами противочумных учреждений [19-23]. Отсутствуют методические документы, регламентирующие критерии выбора и применение штаммов возбудителя туляремии в целях подготовки специалистов. В открытых научно-технических источниках не обнаружено информации о штаммах туляремийного микроба, используемых в учебных целях.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности разработки стандартизированного научно-обоснованного подхода к совершенствованию методической базы и обеспечению биологической безопасности подготовки бактериологов по программам ДПО путем формирования учебного набора штаммов F. tularensis.

Цель исследования - разработка критериев подбора штаммов F. tularensis в качестве учебных принципов формирования и применения набора штаммов для освоения методов лабораторной диагностики туляремии.

Материал и методы

Законодательные и подзаконные акты РФ, нормативные и методические документы, научные публикации по лабораторной диагностике туляремии и биобезопасности работ с ПБА; научно-технические источники; программы профессиональной переподготовки и повышения квалификации специалистов для работ с возбудителями ООИ. Метод исследования: аналитический.

Результаты и обсуждение

Ранее проведен ретроспективный анализ аварийных ситуаций при освоении слушателями курсов профессиональной переподготовки лабораторной диагностики холеры, бруцеллеза, сибирской язвы, туляремии и чумы. Установлено, что с 1972 по 2009 г. апостериорная вероятность возникновения аварий составила р=0,094 для 1 слушателя курсов; периодичность при работе с возбудителем туляремии - 1 авария в 343 учебных часа или 0,08 аварии на протяжении одних курсов [24]. Полностью исключить аварийные ситуации и инфицирование при манипуляциях с патогенным биологическим материалом невозможно, тем не менее можно снизить их вероятность. Один из подходов - подбор штаммов F. tularensis со сниженной вирулентностью, вакцинных и аттенуированных.

Для практической реализации поставленной цели проанализированы учебные планы практических занятий в рамках образовательного модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии", нормативные и информационно-методические документы, регламентирующие методы лабораторного исследования на туляремию, научно-технические источники [19-23].

Установлено, что исследования материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителем туляремии, проводят в специализированных лабораториях (территориальный, региональный и федеральный уровни) Роспотребнадзора, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на проведение работ с ПБА II группы [19, 21, 25, 26].

Для лабораторий каждого уровня нормативно закреплен перечень проводимых ими исследований [19]. Медицинские организации территориального уровня, имеющие лицензию на работу с ПБА III-IV групп, проводят исследования сывороток крови, контроль состояния противотуляремийного иммунитета аллергологическим и иммунологическими методами [туляриновая проба, реакция агглютинации (РА), реакция объемной агломерации, реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА)]. Центры гигиены и эпидемиологии в субъектах РФ, в структуру которых входят лаборатории ООИ, имеющие лицензию на работу с ПБА II-IV групп, осуществляют диагностические исследования материала методами индикации [полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод флюоресцирующих антител (МФА), ИФА, РНГА и др.], постановку биологической пробы, выделение, накопление чистой культуры на питательных средах и идентификацию по сокращенной схеме.

Региональный уровень образуют подразделения противочумных учреждений Роспотребнадзора. Специалисты контролируют состояние иммунитета у вакцинированных; проводят исследование материала от больных (умерших) людей, анализ проб в ходе эпизоотологического обследования территории, окружающей среды. Диагностические исследования осуществляют с помощью методов, применяемых на территориальном уровне, дополняя следующими тестами: определение вирулентности для белых мышей и морских свинок, чувствительности к антибактериальным препаратам, типирование внутри вида. В лабораториях центров индикации, кроме перечисленного выше, осуществляют идентификацию по полной схеме [19].

Комплекс исследований на федеральном уровне включает подробное изучение молекулярно-генетических биохимических свойств выделенных штаммов возбудителя туляремии, а также генетическое типирование и секвенирование ДНК [19, 25]. В результате проведенной окончательной идентификации устанавливают подвидовую принадлежность и генотип выделенных штаммов F. tularensis.

Исходя из этого обучающий процесс, учитывая современные схемы лабораторной диагностики туляремии и принципы организации исследований в лабораториях разного уровня, должен включать:

■ освоение бактериологического, биологического, молекулярно-генетического и иммунологических методов лабораторной диагностики туляремии, применяемых для индикации и идентификации;

■ изучение видовых морфологических, культуральных, биохимических, антигенных свойств, генома возбудителя туляремии; биологических особенностей подвидов, биоваров, отдельных штаммов; алгоритма дифференциации подвидов, в том числе с использованием молекулярно-генетических технологий.

На основании предполагаемых направлений использования, перечней изучаемых биологических свойств, ключевых результатов подготовки специалистов и правил безопасной работы с туляремийным микробом были сформулированы критерии подбора штаммов в качестве учебных:

1) вирулентность для белых мышей (LD50) при подкожном введении должна быть не менее 102 КОЕ [18]. За основу был взят количественный показатель "остаточная вирулентность", предъявляемый к вакцинным штаммам вследствие отсутствия четких критериев, дающих возможность разделить штаммы F. tularensis по вирулентности;

2) типичные видовые культурально-морфологические свойства определенных подвидов F. tularensis;

3) типичный набор генетических маркеров, специфичный для вида F. tularensis и его подвидов F. tularensis tularensis, F. tularensis holarctica EryS/R, F. tularensis japonica, F. tularensis novicida (RD1, pdp D и др.), для аттенуированных штаммов туляремийного микроба (RD18, RD19 и др.);

4) способность формировать патологоанатомические изменения (картина острого сепсиса) во внутренних органах лабораторных животных;

5) чувствительность к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики туляремии.

Все природные штаммы характеризуют по степени патогенности как более или менее патогенные для человека и животных. Наиболее безопасным для применения в учебном процессе является вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, LD50 которого при подкожном введении белым мышам - не менее 102 КОЕ. Высокую вирулентность проявляют штаммы F. tularensis подвида tularensis, вызывая развитие инфекционного заболевания от заражения одной микробной клеткой. Меньшую вирулентность проявляют штаммы подвидов holarctica и mediasiatica, LD50 которых для кроликов более 103-106 КОЕ. Подвид F. tularensis novicida обладает сниженной вирулентностью для кроликов, LD50 более 106 КОЕ. Очевидно, что необходимость реализации учебного плана в полном объеме может обусловить включение в набор штаммов различной вирулентности и потребует рассмотрения вопроса об обеспечении условий для минимизации вероятности инфицирования обучающихся при манипуляциях с ними.

Сотрудниками ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора разработан дифференцированный подход к применению набора учебных штаммов с позиции обеспечения биологической безопасности обучающихся.

Штаммы вакцинный и аттенуированные предполагается выдавать слушателям курсов для индивидуальной работы при изучении типичных свойств возбудителя туляремии, утвержденных методов индикации, сокращенной идентификации и внутривидовой дифференциации.

Штаммы F. tularensis подвида tularensis, F. tularensis подвида mediasiatica, F. tularensis подвида novicida будут использованы преподавателями для демонстрации тестов, определяющих подвидовую принадлежность: ферментации глицерина, цитруллинуреидазной, фосфатазной, пенициллиназной активности, выявления специфичных для подвидов генетических маркеров с помощью ПЦР.

Для освоения биологического метода слушателями курсов будет использован вакцинный штамм F. tularensis подвида holarctica 15 НИИЭГ. Воспроизведение выраженных патологоанатомических изменений (картина острого сепсиса) во внутренних органах лабораторных животных будет проводить преподаватель с применением вирулентных штаммов F. tularensis подвида tularensis или F. tularensis подвида holarctica для демонстрации на практических занятиях.

Будет применен типичный набор генетических маркеров, специфичный для вида F. tularensis и его подвидов F. tularensis tularensis, F. tularensis holarctica FryS/R, F. tularensis japonica, F. tularensis novicida (RD1, pdp D и др.), для аттенуированных штаммов туляремийного микроба (RD18 RD19 и др.) для подготовки преподавателями проб, применяемых для обучения молекулярно-генетическим методам диагностики.

Таким образом, в работе впервые обозначены принципы формирования учебного набора штаммов, перечень критериев подбора штаммов F. tularensis для реализации в полном объеме плана образовательного модуля "Микробиология и лабораторная диагностика туляремии", а также их дифференцированного применения с целью максимального исключения вирулентных штаммов из индивидуальной работы обучающихся, и, как следствие, снижения вероятности их лабораторного инфицирования.

Литература

1. Об основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу: указ Президента РФ от 11.03. 2019 г. № 97. URL: https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/72092478/ (дата обращения: 17.03.2020).

2. Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., Бойко А.В., Вахрушина Н.И., Попов Ю.А. Набор учебных штаммов для освоения лабораторной диагностики чумы // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2017. № 5 (22). C. 22-27.

3. Безопасность работ с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): санитарные правила. СП 1.3.3118-13. // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2013. № 3. С. 95-115.

4. Воробьев А.А., Боев Б.В., Бондаренко В.М., Гинцбург А.Л. Проблема биотерроризма в современных условиях // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. № 3. С. 3-12.

5. Inglesby T.V., Dennis D.T., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E. et al. Plague as a biological weapon: medical and public health management // JAMA. 2000. Vol. 283, N 17. Р. 2281-2290.

6. Об утверждении Списка микроорганизмов, токсинов, оборудования и технологий, подлежащих экспортному контролю: указ Президента РФ от 20 августа 2007 г. № 1083 (с изм. от 14 ноября 2017 г.). URL: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_70610/ (дата обращения 05.03.2020)

7. Кудрявцева Т.Ю., Попов В.П., Мокриевич А.Н., Пакскина Н. Д., Холин А. В., Мазепа А. В. и др. Эпидемическая активность природных очагов туляремии на территории Российской Федерации в 2018 г. и прогноз ситуации на 2019 г. // Проблемы особо опасных инфекций. 2018. № 1. С. 32-41.

8. Об образовании в Российской Федерации: федеральный закон от 29.12.2012 № 273-ФЗ (ред. от 01.03.2020). URL: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_140174/ (дата обращения 05.03.2020)

9. Олсуфьев И.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. Москва : Медицина, 1975. 192 с.

10. Sjostedt A. Virulence determinants and protective antigens of Francisella tularensis II // Curr. Opin. Microbiol. 2003. Vol. 6, N 1. P. 66-71.

11. Titball R.W., Sjostedt A. Francisella tularensis: an overview // ASM News. 2003. Vol. 69, N 11. P. 558-563.

12. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E. et al. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41, N 7. P. 2924-2931.

13. WHO Guidelines on Tularaemia. Geneva : WHO, 2007. 115 p. URL: https://www.who.int/csr/resources/publications/WHO_CDS_EPR_2007_7.pdf?ua=1 (дата обращения 05.03.2020)

14. Мокриевич А.Н., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Вахрамеева Г.М., Горбатов А.А. и др. Методы изучения возбудителя туляремии : практическое пособие / под ред. И.А. Дятлова. Оболенск : ФБУН ГНЦ ПМБ, 2018. Режим доступа: по запросу на почту info@obolensk.org.

15. Gurycová D. First isolation of Francisella tularensis subsp. tularensis in Europe // Eur. J. Epidemiol. 1998. Vol. 14, N 8. P. 797-802.

16. Попов Ю.А., Малюкова Т.А., Тихомирова Л.А., Кутырев В.В. Система подготовки специалистов по биологической безопасности в Российской Федерации // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2016. Т. 5, № 1. С. 11-18.

17. Растунцева Е.В. Тихомирова Л.А., Сазанова Е.В. Алгоритмы обучения специалистов на курсах профессиональной переподготовки и повышения квалификации в ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора // Биозащита и биобезопасность. 2014. № 6. C. 10-16.

18. Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба: методические указания МУ 3.3.1.2161-07. Москва, 2007.

19. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: методические указания МУК 4.2.2939-11. Москва, 2011.

20. Эпидемический надзор за туляремией: методические указания МУ 3.1.2007-05. Москва, 2005.

21. Профилактика туляремии: санитарные правила. СП 3.1.7.2642-10. Москва, 2010.

22. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам: методические указания МУК 4.2.2495-09. Москва, 2009.

23. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза: методические указания МУ 3.3.2.2124-06. Москва, 2006.

24. Сазанова Е.В., Бойко А.В., Малюкова Т.А., Лоцманова Е.Ю. Пути снижения вероятности возникновения аварийных ситуаций при подготовке специалистов для работы с возбудителями I-II групп патогенности // Биозащита и биобезопасность. 2012. № 1. С. 16-20.

25. О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации: приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 // Бактериология. 2017. Т. 2, № 4. С. 66-71.

26. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней : практическое руководство / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. Москва : Шико, 2013. 555 с.

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Ющук Николай Дмитриевич
Академик РАН, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, президент ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России, член Правления Национального научного общества инфекционистов.

Медицина сегодня
Рождественская встреча Школы Отта.

Итоги года и Круглый стол "Акушерство и гинекология от А до Я" на Рождественской встрече Школы Отта. 18-19 декабря 2020 года В рамках образовательного проекта, при поддержке ФГБНУ "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" и...

Пост релиз 15 НКТ

Уважаемые коллеги, благодарим всех, кто принял участие в XV Национальном конгрессе терапевтов 18-20 ноября 2020 года. В этом году мероприятие впервые состоялось в формате онлайн. Помимо российских врачей из всех регионов РФ в Конгрессе приняли участие представители 15...

Московская урологическая школа.

Московская урологическая школа Урология - область медицинской науки, которая интенсивно развивается. Ежегодно появляются новые научные данные, обнародуются результаты исследований и разработок, меняются алгоритмы диагностики и лечения пациентов с теми или иными болезнями...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»