Бруцеллез на современном этапе рассматривается специалистами как один из наиболее опасных зоонозов. Инфицирование человека возбудителями бруцеллеза обычно происходит в результате прямого контакта с выделениями, кровью или сырьем от больных бруцеллезом животных, употребления контаминированных бруцеллами необеззараженных продуктов животного происхождения (молоко, кисломолочные и мясные продукты), вдыхания воздушно-пылевой смеси, содержащей контаминированные бруцеллами фрагменты шерсти, навоза, земли и др. [1].
Практически любой орган и система могут поражаться при бруцеллезе. Это является следствием генерализованного процесса, характерного для заболеваний с выраженными иммунопатологическими реакциями, протекающими на фоне системного воспаления и эндотоксикоза [2].
Основные факторы патогенности бруцелл. Стадии развития бруцеллезной инфекции (патогенетические аспекты)
Известно, что, в отличие от многих патогенов, бруцеллы не проявляют "прямой" агрессии в отношении клеток хозяина - не синтезируют экзотоксины, экзопротеазы, цитолизины или другие агрессивные для макроорганизма субстанции. Воспалительные реакции при бруцеллезе слабоманифестные, имеют преимущественно пролиферативный характер и теснейшим образом ассоциированы с реакциями иммунитета. Вместе с тем воспаление достаточно продолжительное, что обусловлено длительной персистенцией бруцелл в инфицированных тканях, и это в конечном итоге приводит к воспалительной альтерации [2].
Взаимодействие in vivo патогена с клетками иммунной системы происходит в несколько этапов, каждый из которых обусловлен проявлением факторов патогенности бруцелл. В процессе эволюции бруцеллы приобрели более 250 белковых детерминант патогенности, которые определяют в том числе молекулярную мимикрию, что способствует выживанию и размножению возбудителя в организме хозяина [3, 4].
Многие аспекты взаимодействия "паразит-хозяин" указывают на определяющую роль нарушений функции иммунитета в патогенезе инфекционной болезни. Основные факторы патогенности бруцелл обеспечивают реализацию стратегии "скрытого" проникновения в макроорганизм, ингибирование факторов естественной резистентности и уклонение от адаптивного иммунитета (см. таблицу) [2, 5-10].
Основные факторы патогенности бруцелл
В динамике бруцеллезной инфекции условно можно выделить 5 основных фаз: лимфогенного заноса (инициальная фаза), гематогенного заноса (первичная генерализация), полиочаговых локализаций, экзоочаговых обсеменений (вторичная генерализация) и резидуального метаморфоза [11-13].
В инициальную фазу бруцеллы проникают в организм хозяина через поврежденную кожу или слизистые оболочки (в том числе неповрежденные), захватываются фагоцитами и током лимфы (лимфогенно) заносятся в регионарные лимфоузлы. В лимфоузлах накапливаются с образованием первичного бруцеллезного комплекса. Эта фаза хронологически соответствует инкубационному периоду болезни - происходит иммунологическая перестройка организма с образованием специфических антител.
При массивном накоплении возбудителя в условиях формирования индуцированного бруцеллами незавершенного фагоцитоза лимфатические узлы становятся "резервуаром" (очагом) бактерий, откуда патоген может поступать в кровь и распространяться по всему организму, инициируя формирование II фазы - гематогенного заноса (первичная генерализация).
Во II фазу развиваются бактериемия и эндотоксинемия, появляется клиническая симптоматика острого бруцеллеза. С током крови бактерии разносятся по органам, богатым ретикулоэндотелием, и фиксируются в них (фаза полиочаговых локализаций). Далее происходит активация клеток мононуклеарно-макрофагальной системы (ММС), в тканях развиваются диффузные, иммуновоспалительные изменения, формируются очаговые скопления макрофагов с внутриклеточно-паразитирующими в них бруцеллами. Это защитно-приспособительные процессы, направленные на снижение интенсивности бактериемии, локализацию бактерий.
Незавершенный фагоцитоз бруцелл провоцирует явление эндоцитобиоза и активное размножение патогена в цитоплазме фагоцитов. Большинство фагоцитов гибнет, и бактерии, высвобождаясь, гемато- и лимфогенно разносятся по организму (селезенка, печень, костный мозг, лимфатические узлы и др.).
С началом генерализации патологического процесса и формирования метастатических вторичных полиорганных очагов инфекции в виде специфических гранулем происходит иммуноаллергическая перестройка организма (гиперчувствительность замедленного типа).
Фаза резидуального метаморфоза соответствует исходам бруцеллеза, завершающегося либо полной резорбцией (рассасывание, деградация) воспалительных образований, либо формированием стойких функционально-органических изменений в пораженных тканях [11-15].
Взаимодействие патогена с факторами иммунной системы макроорганизма. Роль основных факторов патогенности в индуцировании дисфункции иммунной системы хозяина
Биологический цикл бруцелл в организме хозяина в условиях воздействия на микроорганизм факторов индуцированного патогеном иммунного ответа (в естественных для патогена условиях) характеризуется длительностью течения. На начальных этапах после инфицирования бруцеллы используют механизмы, направленные на противодействие активации факторов врожденного иммунитета за счет присутствия у бактерий особых (модифицированных) патоген-ассоциированных молекулярных структур (PAMPs).
Эффекторные субстанции Brucella BtpA/Btp1/TcpB обеспечивают блокировку (экранирование) распознавания PAMPs Toll-подобными рецепторами (TLR) фагоцитов, подавляя сигнальные пути, опосредованные TLR2/4. Для бруцелл также характерна продукция модифицированного флагеллина, который является слабым индуктором TLR5. Это обеспечивает скрытую, незаметную для хозяина колонизацию клеток ММС и ингибирование интенсивности иммуновоспалительных реакций [15].
Молекулы домена TIR проявляют гомологию с TLR, способствуя снижению активности созревания дендритных клеток и синтезу противовоспалительного цитокина интерлейкина-10 (ИЛ-10), что в совокупности с низкой активностью LPS также способствует угнетению интенсивности воспалительных реакций [17, 18].
Бруцеллы проникают в фагоциты через липидный бислой, избегая его бактерицидного действия и фагосомо-лизосомального слияния. Эта способность бруцелл обеспечивается системой секреции IV типа (T4SS), которая включает 12 структурных генов virBl-virBl2, кодирующих белковые компоненты T4SS и формирующих функциональный оперон, консервативно присутствующий у всех видов бруцелл [19-22].
Помимо T4SS, в реализации механизмов вирулентности бруцелл внутри клеток хозяина принимают участие несколько основных факторов: циклический β-1,2-глюкан, LPS и белок LuxR (регулятор VjbR, контролирует экспрессию факторов вирулентности на ранних стадиях внутриклеточной инфекции) [15].
Имеются различия во взаимодействии S- и R-форм бруцелл с клетками ММС. Бруцеллы в S-форме кооперируют c фагоцитами посредством так называемых липидных рафт (RAFT) - особых участков плазматической мембраны (микродоменов), обогащенных гликосфинголипидами и холестерином.
В инкубационный период у S-бруцелл активно экспрессируются гены, кодирующие синтез O-фрагмента цепи LPS (wboA, manB), обеспечивающие создание условий для внутриклеточной репликации. LPS R-форм бруцелл лишен О-специфических боковых цепей, патоген прикрепляется к плазматической мембране фагоцита с помощью белка наружной мембраны OMP25, детектируется TLR-рецепторами и поглощается фагоцитами. Считается, что R-формы бруцелл имеют более выраженные адгезивные и инвазивные свойства [23, 24].
Внутри фагоцитов бруцеллы локализуются в специальной вакуоли (бруцеллосодержащая вакуоль, BCV). Микросреда внутри BCV имеет ограниченное количество питательных веществ и закисленную агрессивную для бруцелл среду. У патогена существенно замедляется метаболизм, снижаются экспрессия генов и синтез регуляторных белков. На фоне закисления BCV активируется T4SS, запускается селективная транслокация белков и ДНК-белковых комплексов, способствующих достижению S-формами бруцелл репликативных фагосом. У R-бруцелл внутри фагоцита T4SS обеспечивает реализацию механизмов цитотоксичности [25-27].
У бруцелл описаны ряд эффекторных белков T4SS - VceA, VceB, VceC, BspA, BspB, BspF и др., функции которых - участие в молекулярных механизмах взаимодействия со структурами эндоплазматического ретикулума и ингибирование сигнальных путей, синтеза белковых субстанций системы врожденного иммунитета хозяина [22-28].
Внутри вакуоли у бруцелл активируется двухкомпонентная регуляторно-сенсорная система адаптации - BvrR/BvrS, кодируемая опероном bvrRS Brucella (см. рисунок).
Система обеспечивает контроль экспрессии генов, ответственных за сохранение целостности клеточной оболочки, адаптивные изменения интенсивности метаболических процессов и репликации бактерий. BvrR/BvrS система контролирует экспрессию белков наружной мембраны Omp 3a (Omp25) и Omp 3b (Omp22) [16, 18, 29].
Штаммы В. abortus с измененными свойствами клеточной мембраны (bvrRS-мутанты) менее устойчивы к кислой среде фагосом и неспособны локализоваться в эндоплазматической сети фагоцитов (место наиболее активной репликации бруцелл). Мутация в генах BvrR/BvrS препятствует проникновению B. abotrus в нефагоцитирующие клетки и ингибирует внутриклеточное взаимодействие. Дисфункция данной системы изменяет проницаемость внешней мембраны, экспрессию белков наружной мембраны 3-й группы (Omp 3а; Omp 3b) и структуру липида А [18, 29, 30].
У бруцелл описаны растворимые периплазматические белки EipA, EipB наружной мембраны, которые способствуют не только сохранению целостности клеточной оболочки, но и делению бруцелл внутри фагоцитов [31, 32].
К одному из проявлений несостоятельности врожденных механизмов иммунной защиты макроорганизма в отношении бруцелл относят формирование незавершенного фагоцитоза, связанного с нарушениями слияния бактериосодержа-щей вакуоли с лизосомами. Данный механизм опосредован в том числе действием циклического β-1,2-глюкана, который является частью внешней мембраны [29, 33].
Наиболее эффективные механизмы цитотоксичности в отношении бруцелл связаны с активностью Т-клеток CD4+ -продуцентами интерферона-γ (ИФН-γ) и фагоцитами (преимущественно дендритными клетками), синтезирующими индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS/NOS2). Несостоятельность врожденных иммунных механизмов в борьбе с бруцеллами приводит к дефектным Th1-иммунным реакциям и Т-клеточной анергии - одной из основных причин хронизации инфекции [35].
Показано, что острый бруцеллез сопровождается увеличением в крови количества CD4+- и CD8+-лимфоцитов и существенным снижением фагоцитарной активности нейтрофилов. При хронической форме наблюдается снижение уровня Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов. Выявленные изменения свидетельствуют о формировании вторичной иммуносупрессии как при острой (ослабление фагоцитоза), так и при хронической (снижение количества субпопуляций Т-лимфоцитов) форме течения болезни [36].
Имеются данные о формировании у больных хроническим бруцеллезом дисбаланса Th1/Th2 иммунных реакций в сторону увеличения цитокин-продуцирующей активности Th2-клеток, обеспечивающих в большей степени гуморально-опосредованный иммунитет. Повышение количества и активности Th2-клеток способствует ингибированию клеточно-опосредованного иммунитета (Th1), что также может обеспечивать хронизацию бруцеллеза [37].
У больных бруцеллезом отмечается повышение в периферической крови количества CD4+ T-регуляторных клеток (Treg).
Модель (схема) двухкомпонентной регуляторно-сенсорной системы адаптации (BvrR/BvrS) у бруцелл (цит. по [34])
mRNA - матричная РНК; BvrR/BvrS - двухкомпонентная регуляторно-сенсорная система адаптации; VirB - структурные гены; vjbR - транскрипция оперона; PM - плазматическая мембрана; IM - внутренняя мембрана; ОМ - наружная мембрана.
При этом у больных хронической формой инфекции изменения более выражены. Treg подавляют пролиферацию и реактивность других субпопуляций Т-лимфоцитов, что способствует ограничению активации CD4+- и СD8+-лимфоцитов [38-40].
На начальных этапах развития иммуновоспалительной реакции при бруцеллезе у заболевших резко увеличивается количество циркулирующих Т-лимфоцитов определенного типа - Vγ9Vδ2 (T-γ9δ2), способных ингибировать внутриклеточную репликацию и выполнять специфическую роль в контроле инвазии патогена за счет реализации механизмов цитотоксичности (синтез перфоринов, гранзимов и гранулизинов, индуцированный апоптоз). При экспериментальном моделировании (in vitro) инфицирования макрофагов штаммами B. suis было показано, что патоген способствовал снижению активности Tγ9δ2, которое, вероятно, связано с ослаблением распознавания инфицированных макрофагов Т-лимфоцитами и их устойчивостью к цитотоксическому действию [41-43].
Кооперация TLR c компонентами микробной клетки бруцелл, липидом А и особой формой CpG-ДНК инициирует продукцию противовоспалительного цитокина - ИЛ-10, который способствует подавлению синтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1), интерферонов, фактора некроза опухоли и снижению активности макрофагов. Важной особенностью ИЛ-10 в иммуногенезе бруцеллеза является его способность стимулировать синтез IgE, участвовать в формировании реагин-опосредованной специфической сенсибилизации организма в начальный период заболевания [44].
Определена роль EK-клеток (естественных киллеров, NK) в формировании специфического иммунного ответа. Показано, что интенсивность антителогенеза при введении инактивированных клеток B. abortus в большей степени зависела от уровня и активности EK-клеток и лишь частично - от концентрации ИФН-у или ИЛ-12. При селективном удалении EK установлено не менее чем двукратное снижение интенсивности выработки антител. Оценка интенсивности экспрессии маркеров антиген-стимулированной активации (CD69) на B- и NK-клетках показала, что антиген приводит к активации большого количества спленоцитов (моноцит, образующийся в ретикулярной ткани селезенки), однако наиболее раннюю индукцию детектировали на EK-клетках [45, 46].
Важную роль в функционировании противоинфекционного клеточно-опосредованного иммунитета играют инвариантные NKT-клетки (iNKT, фенотип CD3+CD16+CD56+) -подгруппа Т-лимфоцитов (подварианты с экспрессией коре-цептора CD4+ и CD8+). Доказана способность CD4+ iNKT-клеток ингибировать внутримакрофагальный рост бруцелл. Реализация механизмов цитотоксичности в отношении инфицированных макрофагов опосредована сочетанием растворимых, контактно-зависимых механизмов (синтез ИФН-γ) и цитотоксической активностью (индукция пути Fas, высвобождение литических гранул) [47].
У больных острым бруцеллезом наблюдается увеличение количества NKT-клеток в периферической крови, что, вероятно, обусловлено недостаточностью иммунного ответа со стороны NK-клеток и снижением числа Т-лимфоцитов в случае невозможности элиминации бруцелл иммунокомпетентными клетками [48].
Известно, что у больных бруцеллезом формируются реакции гиперчувствительности немедленного - IgE-зависимого и замедленного - лимфоцит-опосредованного типов. У больных острым бруцеллезом с высокой степенью IgE-зависимой специфической сенсибилизации установлено формирование выраженной иммуносупрессии. Повышение уровня лимфоцит-опосредованной специфической сенсибилизации обратно коррелирует с выраженностью патофизиологических изменений в иммунном статусе [49, 50].
Анализ иммунопатологической концепции
Анализ научных публикаций по проблеме патогенеза бруцеллезной инфекции позволяет выделить 4 основных этапа в процессе, посредством которого внутриклеточная бактерия вызывает длительную инфекцию (хронизацию): инвазия в организм хозяина, характеризующаяся периодами локализации и адаптации к условиям среды обитания; создание ниши для выживания и размножения внутри клеток-мишеней (эпителиальные или способные к фагоцитозу клетки); противостояние механизмам естественной резистентности и преодоление адаптивного иммунитета.
Большинство факторов вирулентности бруцелл обеспечивает реализацию первых двух этапов (вторжение в клетки-мишени, адаптация и интрацеллюлярное размножение). Важным механизмом патогенного действия бруцелл, обеспечивающим длительную внутриклеточную локализацию возбудителя, является ингибирование апоптоза, что способствует сохранению "комфортной" среды для размножения бруцелл и их защиты от элиминации. Вместе с тем бруцеллы способны индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов, что обеспечивает защиту от адаптивного иммунитета.
Продолжительный инкубационный период бруцеллезной инфекции, вероятно, обусловлен ингибированием бруцеллами врожденного иммунитета, что отражается в первую очередь на ММС. После проникновения в организм хозяина бруцеллы защищают себя от факторов естественной резистентности - распознавание TLR и агрессивное действие системы комплемента. Ослабление способности иммунокомпетентных клеток хозяина обнаруживать антигенные детерминанты бруцелл оказывает эффект снижения интенсивности воспалительной реакции организма и в конечном счете провоцирует ослабление цитотоксической активности CD8+ лимфоцитов, снижает потенциал естественного (слабая презентация фагоцитами и дендритными клетками экзогенных белков) и адаптивного иммунитета против бруцелл, что и приводит к хронизации инфекции.
Макрофаги и дендритные клетки считаются ключевыми элементами врожденного иммунного ответа против внутриклеточных бактерий, таких как бруцелла. На начальных стадиях после инфицирования организма хозяина бруцеллы незаметно колонизируют клетки-мишени без манифестации иммуновоспалительной реакции. Типичный антибактериальный иммунный ответ - приток микрофагов к очагу инфекции - не формируется. T4SS бруцелл инициирует активацию интерферон-регулируемых генов, генерируемый иммунный ответ недостаточен, чтобы элиминировать патоген.
В случае адаптации бруцелл к среде внутри макрофагов патоген расширяет локализацию, мигрируя в ткани опорнодвигательной, мочеполовой, сердечно-сосудистой (эндотелий) и нервной систем.
Важнейшее патогенетическое значение имеет формирование специфической гиперчувствительности. Учитывая внутриклеточный паразитизм, бруцеллы длительно пер-систируют в организме хозяина, вызывая его специфическую сенсибилизацию за счет образования эндотоксина, продуктов жизнедеятельности, антигенемии, что проявляется в инициации патофизиологической стадии развития аллергической реакции. Повышение степени IgE-зависимой специфической сенсибилизации ассоциировано с формированием выраженной иммуносупрессии. Первичная генерализация бруцеллезной инфекции обычно протекает на фоне отрицательных кожно-аллергических проб, соответственно отсутствие или низкая специфическая сенсибилизация лимфоцитов на фоне подавленного фагоцитоза обусловливает несостоятельность клеточного иммунитета. В свою очередь, нозогенная иммуносупрессия, инициированная возбудителем, является причиной массивной бактериемии с формированием вторичных очагов инфекции - "микробное депо" (лимфатические узлы, селезенка, костный мозг).
Реакция гиперчувствительности замедленного типа, обусловленная клеточными факторами иммунитета, преимущественно лимфоцитами, по своей сути - специфический иммунный механизм защиты, который направлен на локализацию и дальнейшую элиминацию возбудителя через специфическое гранулематозное воспаление. Соответственно интенсивность специфической реактивности лимфоцитов является отражением интенсивности (силы) противобруцеллезного клеточного иммунитета.
Исходя из вышеизложенного можно заключить, что высокий уровень специфической клеточно-опосредованной сенсибилизации не ассоциирован с формированием иммуносупрессии при бруцеллезе. Вероятно, это обусловлено тем, что активность клеточных механизмов иммунитета, в частности лимфоцитов, является определяющей при бактериальных инфекциях с внутриклеточным паразитированием, соответственно высокая интенсивность лимфоцит-зависимой сенсибилизации в большей степени отражает устойчивость к патогену.
Можно предположить, что наиболее опасным при остром бруцеллезе с точки зрения генерализации этиологического агента (возбудителя бруцеллеза) с переходом в хронический бруцеллез, а также большого риска активизации условнопатогенной микрофлоры или вторичного наслоения патогенных микроорганизмов является течение болезни с высокой степенью реагин-зависимой и низкой интенсивностью клеточно-опосредованной специфической сенсибилизации. Соответственно больным бруцеллезом с выраженной IgE-обусловленой аллергизацией необходима более длительная антибактериальная терапия с включением в схему лечения десенсибилизирующих средств и иммуномодуляторов, а больным с низкой интенсивностью лимфоцит-зависимой сенсибилизации - назначение стимуляторов клеточного иммунитета.
Таким образом, проявление патогенных свойств бруцелл и их "судьба" в организме хозяина тесно ассоциированы с воздействием на патоген факторов врожденного иммунитета. На исход "борьбы" естественного иммунитета с бру-целлами оказывает влияние баланс между продуктивными и контрпродуктивными эффектами противодействующих сил. При физиологически нормальном функционировании иммунной системы вектор иммунологических реакций при бруцеллезе будет определяться свойствами патогена: способностью к блокировке завершенного фагоцитоза (преимущественно результат действия T4SS), ингибированию апоптоза инфицированных фагоцитов, индукции анергии при формировании иммуновоспалительной реакции (ингибирование созревания антиген-презентирующих клеток, премирования Т-лимфоцитов).
Патогенетической основой практически закономерной трансформации острой стадии инфекции в хроническую является индуцированная патогеном несостоятельность иммунитета в отношении бруцелл с созданием условий для незавершенного фагоцитоза и долгосрочного внутриклеточного паразитирования. Исход при бруцеллезе определяется прежде всего состоянием именно клеточного иммунитета, так как инфекция часто протекает на фоне достаточно высокого уровня циркулирующих антител, которые не обеспечивают защиту макроорганизма и не препятствуют формированию бактерионосительства.
Состояние проблемы бруцеллезной инфекции требует продолжения изучения особенностей специфической сенсибилизации как одного из ведущих механизмов в патогенезе бруцеллеза, а также совершенствования диагностики, прогнозирования течения болезни и терапии.
Исследование патофизиологических особенностей бруцеллеза с выявлением существующих взаимосвязей многочисленных клинических проявлений с лежащими в их основе индивидуальными физиологическими и патологическими реакциями организма на данную инфекцию позволят объективизировать критерии активности инфекционного процесса. Накопленные данные о биологии бруцелл определяют дальнейшее развитие научных исследований, направленных на разработку активных соединений и изучение их действия на компоненты главного фактора патогенности бруцелл-систему секреции IV типа, реализация потенциала которой обеспечивает возбудителю бруцеллеза выживаемость, адаптацию и персистенцию в организме хозяина.
Результаты исследований последних лет позволяют сформировать иммунопатологическую концепцию для понимания развития болезни, основанной на закономерностях молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия бруцелл с факторами естественного и адаптивного иммунитета хозяина.
Очевидно, что особенности инвазии и дальнейшей персистенции бруцелл, а также инфекционно-аллергический характер бруцеллеза указывают на определяющую роль нарушений иммунитета в патогенезе заболевания. Наиболее яркой спецификой иммунопатогенеза бруцеллеза является многообразие способов защиты возбудителя от иммунной системы макроорганизма, что лежит в основе персистенции возбудителя и возможности развития хронических форм заболевания.