Формирование резистентности к азолам клинического изолята Candida auris - возбудителя кандидемии

Резюме

Candida auris - новый возбудитель грибковых инфекций, который активно распространяется по всему миру и характеризуется повышенной природной устойчивостью к противогрибковым препаратам. Наличие генов-ортологов C. albicans в геноме C. auris предполагает как общее происхождение видов, так и, возможно, общие механизмы формирования резистентности к противогрибковым препаратам.

Цель исследования - определение роли однонуклеотидных замен в генах ERG11, ERG3 и FKS1 клинического изолята C. auris в формировании устойчивости к противогрибковым препаратам (азолам, эхинокандинам).

Материал и методы. Объект исследования - штамм C. auris РКПГ 1821, резистентный к флуконазолу (>256 мкг/мл), возбудитель первого случая кандидемии, зарегистрированного на территории РФ у пациентки отделения реанимации и интенсивной терапии одного из стационаров Москвы. Видовая идентификация была подтверждена MALDI-TOF масс-спектрометрией (диапазон Score Value 1.704-1.898; категория идентификации B) и с помощью секвенирования внутренней транскрибируемой спейсерной области (ITS) рДНК (GenBank MG706148) и генного локуса TEF1α (GenBank MG596888). Однонуклеотидный полиморфизм генов ERG11, ERG3 и FKS1 был определен в ходе полногеномного секвенирования штамма с использованием секвенатора MiSeq парноконцевыми чтениями длинной по 250 п.о. Черновая последовательность генома была депонирована в GenBank под инвентарным номером SBI000000000. Поиск однонуклеотидного полиморфизма генов выполнен в программе Harvest Parsnp.

Результаты и обсуждение. Филогеномная реконструкция на основе однонуклеотидного полиморфизма всего генома показала, что изолят C. auris РКПГ 1821 принадлежит к индопакистанской (южно-азиатской) кладе. Транслированные последовательности ERG11 штамма РКПГ 1821 содержали аминокислотные замены F105L и K143R, которые ранее были ассоциированы с формированием устойчивости у C. albicans. Выравнивание аминокислотных последовательностей генов ERG3 и FKS1 C. auris РКПГ 1821 с последовательностями соответствующих белков C. albicans не выявило каких-либо мутаций, которые потенциально были бы ответственны за устойчивость к противогрибковым соединениям.

Заключение. Выявлены мутации F105L и K143R гена ERG11, ассоциированные с формированием резистентности к азолам у C. auris.

Ключевые слова:Candida auris, резистентность к противогрибковым препаратам, полногеномное секвенирование, однонуклеотидный полиморфизм, гены ERG11, ERG3, FKS1

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Васильева Н.В., Тараскина А.Е., Богомолова Т.С., Выборнова И.В., Пчелин И.М., Рябинин И.А., Азаров Д.В., Апалько С.В., Романюк С.А., Щербак С.Г., Круглов А.Н. Формирование резистентности к азолам клинического изолята Candida auris - возбудителя кандидемии // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 9, № 2. С. 70-76. DOI: 10.33029/2305-3496-2020-9-2-70-76

Грибы рода Candida в различных регионах мира - наиболее широко распространенные возбудители оппортунистических нозокомиальных микозов человека, которые в большинстве случаев протекают в тяжелых формах (кандидемии или острого диссеминированного кандидоза). В Российской Федерации в соответствии с рекомендациями Leading International Fungal Education (LIFE), заболеваемость инвазивным кандидозом (ИК) составляет 8,3 на 100 тыс. населения [1]. Количество летальных исходов в мире от инфекций, вызванных микроскопическими грибами, сопоставимо с таковым при туберкулезе (более 1 660 000 и 1 800 000 соответственно) [2, 3].

Одной из современных мировых тенденций, отягощающих проблему нозокомиальных инфекций, является нарастание резистентности к противомикробным препаратам, в том числе к антимикотикам. По данным многоцентрового исследования инфекций кровотока (ИК), в Российской Федерации каждый 4-й возбудитель рода Candida устойчив к флукона-золу, а среди грибов группы Candida-non-albicans количество штаммов с пониженной чувствительностью к азолам составляет около 40% [4].

Особую роль в этиологии ИК играют представители отдельных видов рода Candida, обладающие первичной устойчивостью к противогрибковым препаратам (антимикотикам). Среди них можно выделить Candida auris - новый возбудитель жизнеугрожающих нозокомиальных микозов, обладающий резистентностью к флуконазолу (за исключением восточно-азиатской клады) и вариабельной чувствительностью к другим азолам, амфотерицину В и эхинокандинам. По биохимическим свойствам (ассимиляции и ферментации сахаров) этот вид сходен с группой ряда видов Candida (C. haemulonii, C. duobushaemulonii, C. pseudohaemulonii, С. sake, C. famata, C. catenulate, C. lusitaniae, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii) [5], что в значительной степени создает проблемы индентификации C. auris на основе биохимических свойств.

Летальность, ассоциированная с колонизацией кровотока C. auris, достигает 30-60% [6]. Важной особенностью данного микромицета также является способность вызывать ИК высокой контагиозности, что до сих пор не было присуще видам рода Candida [7, 8]. Это в значительной степени затрудняет мероприятия по эпидемиологическому контролю в стационаре и создает условия для трудно ликвидируемых вспышек ИК, обусловленных C. auris [9].

C. auris - новый возбудитель микоза, активно распространяющийся по всему миру [9-11]. Первоначально C. auris был выделен в 2008 г. в Японии у пациента из слухового прохода при поверхностном микозе, имеются сообщения о случаях инфекционной патологии, связанной с данным патогеном (кандидемия и диссеминированный кандидоз) во многих странах 6 континентов [12]. В 2017 г. в Российской Федерации был зарегистрирован 1-й случай кандидемии, этиологическим агентом которой признан C. auris [13]. Культура депонирована в Российскую коллекцию патогенных грибов (РКПГ 1821).

Сравнительный анализ геномов изолятов C. auris и C. albicans показал, что некоторые гены-ортологи, ассоциированные с противогрибковой резистентностью, присутствуют в геноме C. auris, включая транспортеры для лекарственных препаратов, секретируемые протеазы и маннозилтрансферазы [10]. Кроме того, было подтверждено сохранение в геноме C. auris генов, кодирующих белки - мишени действия различных классов противогрибковых препаратов: мишени действия азолов - ланостерол 14α-деметилазу (ERG11), дельта(7)-стерол 5(6)-десатуразу (ERG3) и мишень действия эхинокан-динов -β1,3-глюкан-синтетазу (FKS1) [9, 14].

Цель исследования - определение роли однонуклеотидных замен в генах ERG11, ERG3 и FKS1 клинического изолята C. auris в формировании устойчивости к противогрибковым препаратам (азолам, эхинокандинам).

Материал и методы

Штамм C. auris получен из крови пациентки 88 лет, находившейся в отделении реанимации и интенсивной терапии одного из стационаров Москвы. Основное заболевание -острое нарушение мозгового кровообращения. Факторами риска развития кандидемии были иммуносупрессия, искусственная вентиляция легких, использование антибиотиков широкого спектра действия. Несмотря на противогрибковую терапию анидулафунгином в течение 6 нед, пациентка скончалась. Видовая идентификация C. auris была подтверждена MALDI-TOF масс-спектрометрией в ручном режиме ионизации (диапазон Score Value 1.704-1.898; категория идентификации B), секвенированием внутренней транскрибируемой спейсерной области (ITS) рДНК (GenBank MG706148) и генного локуса TEF1α (GenBank MG596888) [13], как было описано ранее [15].

Определяли чувствительность к антимикотикам с использованием колориметрических панелей Sensititre YeastOne YO10 (ThermoFisher Scientific, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Установлены минимальные ингибирующие концентрации, мкг/мл: анидулафунгин - 0,25, микафунгин - 0,25, каспофунгин - 0,25, фторцитозин - 0,12, позаконазол - 0,25, вориконазол -2,00, итраконазол - 0,25, флуконазол >256, амфотерицин В - 0,50 [13]. Для выделения ДНК использовали 2-дневную культуру C. auris. Геномную ДНК экстрагировали с использованием мининабора GeneJET (Thermo Scientific, Вильнюс, Литва). Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit (Invitrogen, США).

Полногеномный анализ штамма Candida auris РКПГ1821 проведен секвенированием генома на базе научного подразделения ГБУЗ "Городская клиническая больница № 40" ДЗМ. Качество и количество геномной ДНК (гДНК) оценивали с использованием квантового флюорометра dsDNA (Promega, Madison, WI, США). Секвенирование ДНК всего генома включало этапы фрагментации геномной ДНК до средней длины 500 пар нуклеотидов с использованием сфокусированного ультразвука Covaris S2 (Covaris, США) в соответствии с протоколом производителя. Оценка качества полученных фрагментов гДНК проведена с использованием TapeStation 2200 (Agilent Technologies, США), захват целевых областей путем гибридизации библиотеки образцов ДНК - с помощью набора для подготовки библиотеки Kapa HTP (Roche, США) и получение чтений - с использованием секвенатора MiSeq (Illumina, США) парноконцевыми чтениями длиной по 250 пар оснований.

Контроль качества чтения и сборки de novo был выполнен, как описано ранее [16]. Необработанные считывания (риды) были переданы в архив последовательностей ридов (Sequence Read Archive) Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (идентификатор биопроекта PRJNA514082).

Черновая последовательность генома штамма C. auris РКПГ 1821 была депонирована в GenBank под инвентарным номером SBI000000000. Филогеномная реконструкция выполнена на сервере CSIPhylogeny 1.4 [17]. Геномная последовательность штамма B8441 [10] была использована в качестве эталона для определения однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) генома C. auris. В качестве референтных последовательностей C. albicans были взяты последовательность штамма SC5314 (ASM1829v3 GenBank), чувствительного к антимикотикам, в том числе препаратам азолового ряда и эхинокандинам, и последовательность штамма СA_99_PD (MF411453 GenBank), резистентного к флуконазолу (MIC 300 мг/л).

Результаты и обсуждение

Полная сборка генома C. auris РКПГ 1821 состояла из 662 контигов общей длиной 12,5 Мб, сходных с таковыми у других видов Candida. Содержание GC составляло 45%, а число предсказанных генов - 5156.

В настоящее время определенно известно, что глобальная популяция C. auris состоит из 4 географических групп (клад) - южно-азиатской (индопакистанской), южноафриканской, японской и южно-американской (венесуэльской) [5]. Клады C. auris обладают очень низкой генетической вариабельностью внутри группы и рядом характерных различий между группами.

Доказано, что клинические изоляты C. auris, принадлежащие к разным кладам, обладают различной степенью вирулентности и резистентностью к противогрибковым препаратам. Изоляты японской линии практически авирулентны и чувствительны к антифунгальной терапии, а инфицирование изолятами индопакистанской клады в 30-60% случаев приводило к летальному исходу [6]. Филогеномная реконструкция на основе ОНП всего генома показала, что изолят C. auris РКПГ 1821 принадлежит к южно-азиатской (индопакистанской) кладе, характеризующейся тотальной резистентностью к флуконазолу.

Исследуемый штамм C. auris РКПГ 1821 также проявлял природную устойчивость к флуконазолу. Одним из наиболее важных и хорошо изученных механизмов возникновения устойчивости микромицетов к действию противогрибковых средств является модификация генов, кодирующих мишени данных препаратов [18].

Соединения азольного ряда направленно действуют на ферменты биосинтеза эргостерола, в основном Erg11 и Erg3, инактивируя их, связываясь в активных центрах ферментов, что приводит к нарушению липидного состава клеточной мембраны клетки микроскопического гриба. Поскольку аминокислотные остатки, ответственные за формирование активного центра, консервативны у разных видов дрожжей, существует возможность по хорошо охарактеризованным мутациям, приводящим к развитию устойчивости у одного вида, судить об аналогичной роли для тех же мутаций у другого вида. Так как большинство генов C. albicans, связанных с устойчивостью к азолам, свойственно и C. auris, можно предположить, что лекарственная устойчивость C. auris, вероятно, включает механизмы, ранее описанные у C. albicans [5].

Изучаемые транслированные последовательности ERG11 штамма РКПГ 1821 содержали аминокислотные замены F105L и K143R (рис. 1), которые ранее были ассоциированы с формированием устойчивости у C. albicans [19]. Выравнивание аминокислотной последовательности гена ERG3 C. auris РКПГ 1821 с последовательностями соответствующих белков C. albicans не выявило никаких мутаций (рис. 2), которые потенциально были бы ответственны за устойчивость к противогрибковым соединениям.

Рис. 1. Выравнивание транслированных последовательностей гена ERG11 Candida auris РКПГ1821 и C. albicans SC5314

В строках приведена аминокислотная последовательность белка, кодируемая изучаемым геном.

Рис. 2. Выравнивание транслированных последовательностей гена (аминокислотных) ERG3 Candida auris РКПГ 1821 и C. albicans B311

Ранее S. Lockhart и соавт. обнаружили, что замены в ERG11 были тесно связаны с географическими кладами. В частности, индийские и пакистанские штаммы характеризовались наличием аминокислотных замен Y132F и K143R [10]. Однако мутация Y132F в изучаемом штамме C. auris РКПГ 1821 не была идентифицирована.

Мутация F105L локализуется в а-спиральном домене B белка Erg11, K143R - а-спиральном домене C [20]. Эти два аминокислотных остатка не входят в число тех, которые отвечают за различные взаимодействия в активном центре фермента, но гетерологичная экспрессия ERG11 C. auris в гаплоидном штамме Saccharomyces cerevisiae, несущем мутацию, приводящую к замене K143R, повышает минимальные ингибирующие концентрации флуконазола в 4-8 раз, а вориконазола - в 2-4 раза [21].

Поскольку длительная терапия эхинокандином у пациентки не была успешной, проанализировано наличие мутаций в генах, ассоциированных с формированием устойчивости к эхинокандинам. Однако ген FKS1 штамма РКПГ 1821 не обладал никакими известными мутациями, определяющими устойчивость к эхинокандину, из мутационного репертуара FKS1 C. glabrata и C. albicans (рис. 3).

Рис. 3. Выравнивание транслированных последовательностей гена (аминокислотных) FKS1 Candida auris РКПГ 1821 и C. albicans SC5314

Современный детальный сравнительный геномный анализ, включающий новые геномные данные для близкородственных C. auris мультирезистентных видов, раскрыл эволюцию этой группы новых патогенов, выявил общие свойства, которые лежат в основе резистентности к противогрибковым препаратам и вирулентности [5]. Несмотря на то что C. auris обладает белками, отвечающими за транспорт лекарственных препаратов, общими с C. albicans, у C. auris и ее близкородственных видов (C. haemulonii, C. duobushaemulonii, C. pseudohaemulonii) наблюдается диверсификация (расширение набора) транспортеров [10].

Все эти 4 вида мультирезистентны к противогрибковым препаратам, и ранее описанные сайты точечных мутаций ERG11 в геноме C. auris сохраняются в большинстве клинических изолятов группы C. haemulonii. Несмотря на то что существуют доказательства увеличения количества копий ERG11 в изолятах C. auris (подобный механизм формирования резистентности описан у C. albicans), доказательств анеуплоидии (изменение кариотипа) не получено [5]. Другие механизмы устойчивости к противогрибковым препаратам варьируют между хорошо изученными видами Candida и активно эволюционирующими. Например, белки эффлюкса семейства CDR (Candida drug resistance), вовлеченные в формирование резистентности к противогрибковым препаратам у C. albicans и C. glabrata, не индуцировались у штаммов C. auris во время терапии амфотерицином В и вориконазолом. Однако наблюдали повышение экспрессии генов ряда альтернативных транспортеров, большинство из них уникальны для C. auris и близкородственных ей мультирезистентных видов [22].

Напротив, экспансия семейств генов, кодирующих белки клеточной стенки, ассоциированная с формированием биопленок, определенная у C. albicans, не найдена у C. auris и родственных ей мультирезистентных видов.

Гены семейства белков, обладающих амилоидными свойствами, ALS (agglutinin-like sequence) в геноме C. auris и родственных ей мультирезистентных видов представлены от 2 до 4 копий, тогда как в геноме C. albicans 8 копиями [9]. Предполагают, что более длинная история эволюции взаимодействий с организмом человека способствует диверсификации генов, кодирующих белки клеточной стенки, в более распространенных патогенных видах Candida [5, 9]. Несмотря на наличие общих молекулярных механизмов, в целом набор генов, белки которых участвуют в формировании резистентности, между C. albicans/C. glabrata и C. auris/группой C. haemulonii несколько различен.

Заключение

Проведение дальнейших исследований с расширенным перечнем генов-кандидатов, ассоциированных с формированием резистентности, а также включение в анализ большего количества штаммов C. auris будет способствовать изучению механизмов формирования резистентности к противогрибковым препаратам. Кроме того, дальнейшие исследования позволят выявить биомаркеры, которые будут основой для разработки тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для быстрого определения чувствительности микроскопического гриба к противогрибковым препаратам.

Литература/References

1. Klimko N., Kozlova Y., Khostelidi S. et al. The burden of serious fungal diseases in Russia. Mycose. 2015; 58 (suppl 5): 58-62.

2. GAFFI: Global Action Fund for Fungal Infections. URL: https://www.gaffi.org/

3. Cornely O.A., Lass-Flor C., Lagrou K., Arsic-Arsenijevic V., Hoenigl M. Improving outcome of fungal disease - guiding experts and patients towards excellence. Mycoses. 2017; 60: 420-5.

4. Vasilyeva N., Raush E., Bogomolova T.S., Shagdileeva E., Klimko N. Species distribution and susceptibility testing of Candida spp. isolated from patients with invasive candidosis in Russia. In: Mycoses. Special Issue: 7th Trends in Medical Mycology, 9-12 October 2015. Lisbon, Portugal. 2015; 58 (suppl S4): 149.

5. Munoz J.F., Gade L., Chow N.A., Loparev V.N., Juieng P., Farrer R.A., et al. Genomic basis of multidrug-resistance, mating, and virulence in Candida auris and related emerging species. Nat Commun. 2018; 9 (1): 5346.

6. Lu P.L., Liu W.L., Lo H.J., Wang F.D., Ko W.C., Hsueh P.R., et al. Are we ready for the global emergence of multidrug-resistant Candida auris in Taiwan? J Formos Med Assoc. 2017; 117: 462-70.

7. Jeffery-Smith A., Taori S.K., Schelenz S., et al. Candida auris: a review of the literature. Clin Microbiol Rev. 2017; 31 (1): e00029-17.

8. Riat A., Neofytos D., Coste A., et al. First case of Candida auris in Switzerland: discussion about preventive strategies. Swiss Med Wkly. 2018; 148: w14622.

9. Chowdhary A., Sharma C., Meis J.F. Candida auris: a rapidly emerging cause of hospital-acquired multidrug-resistant fungal infections globally. PLoS Pathogens. 2017; 13 (5): e1006290.

10. Lockhart S.R., Etienne K.A., Vallabhaneni S., Farooqi J., Chowdhary A., Govender N.P., et al. Simultaneous emergence of multidrug-resistant Candida auris on 3 continents confirmed by whole-genome sequencing and epidemiological analyses. Clin Infect Dis. 2017; 64 (2): 134-40.

11. Sekyere J.O. Candida auris: a systematic review and meta-analysis of current updates on an emerging multidrug-resistant pathogen. Microbiol Open. 2018; 7: e578.

12. Cortegiani A., Misseri G., Fasciana T., Giammanco A., Giarratano A., Chowdhary A. Epidemiology, clinical characteristics, resistance, and treatment of infections by Candida auris. J Intensive Care. 2018; 6 (69): 1-13.

13. Vasilyeva N.V., Pchelin I.M., Ryabinin I.A., Raush E.R., Chilina G.A., Bogomolova T.S.. et al. The first Russian case of candidaemia due to Candida auris. 28th ECCMID. 2018.

14. Chatterjee S., Alampalli S.V., Nageshan R.K., Chettiar S.T., Joshi S., Tatu U.S. Draft genome of a commonly misdiagnosed multidrug resistant pathogen Candida auris. BMC Genomics. 2015; 16: 686.

15. Pchelin I.M., Zlatogursky V.V., Rudneva M.V., et al. Reconstruction of phylogenetic relationships in dermatomycete genus Trichophyton Malmsten 1848 based on ribosomal internal transcribed spacer region, partial 28S rRNA and beta-tubulin genes sequences. Mycoses. 2016; 59: 566-75.

16. Pchelin I.M., Azarov D.V., Churina M.A., Scherbak S.G., Apalko S.V., Vasilyeva N.V., et al. Species boundaries in the Trichophyton mentag-rophytes/T. interdigitale species complex. Med Mycol. 2018; 57 (6): 781-9. DOI: 10.1093/mmy/myy115.

17. Kaas R.S., Leekitcharoenphon P., Aarestrup F.M., Lund 0. Solving the problem of comparing whole bacterial genomes across different sequencing platforms. PLoS One. 2014; 9 (8): e104984.

18. Cowen L.E., Sanglard D., Howard S.J., Rogers P.D., Perlin D.S. Mechanisms of antifungal drug resistance. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014; 5 (7): a019752.

19. Morio F., Jensen R.H., Le Pape P., Arendrup M.C. Molecular basis of antifungal drug resistance in yeasts. Int J Antimicrob Agents. 2017; 50 (5): 599-606.

20. Hargrove T.Y., Friggeri L., Wawrzak Z., Qi A., Hoekstra W.J., Schotz-inger R.J., et al. Structural analyses of Candida albicans sterol 14a-demethy-lase complexed with azole drugs address the molecular basis of azole-mediated inhibition of fungal sterol biosynthesis. J Biol Chem. 2017; 292 (16): 6728-43.

21. Healey K.R., Kordalewska M., Jimenez Ortigosa C., Singh A., Berrfo I., Chowdhary A., et al. Limited ERG11 mutations identified in isolates of Candida auris directly contribute to reduced azole susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 2018; 62 (10): e01427-18.

22. Prasad R., Goffeau A. Yeast ATP-binding cassette transporters conferring multidrugresistance. Annu Rev Microbiol. 2012; 66: 39-63.


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»