В результате роста показателя пораженности ВИЧ-инфекцией все больше пациентов подвергаются риску развития осложнений, в том числе почечной патологии. Это определяет особенность инфекционного процесса ВИЧ-инфекции, при котором отмечают полиорганные поражения [1, 2].
Согласно международным рекомендациям, с целью диагностики патологии почек необходимо проводить скрининговые исследования для определения протеинурии и снижения скорости клубочковой фильтрации - важных маркеров хронической болезни почек (ХБП) [3]. Установлено, что поражение почек независимо от стадии ВИЧ-инфекции характеризуется прогрессирующим течением с развитием тяжелых осложнений, что определяет необходимость раннего обнаружения признаков почечной дисфункции [4, 5].
Оценка параметров клеточного и цитокинового звеньев иммунного ответа при поражении почек у ВИЧ-инфицированных остается предметом интенсивного изучения. Немаловажное значение имеет выявление особенностей клеточного состава лимфоцитов, цитокинового профиля и других иммунологических показателей, а также влияния вирусной нагрузки (РНК ВИЧ) на развитие и прогрессирование почечной патологии. Определение взаимосвязи этих показателей, сопоставление их по выраженности иммунодефицита с учетом уровня цитокинов и виремии создадут предпосылки для более полного понимания механизмов повреждения почек при ВИЧ-инфекции.
Цель исследования - оценка роли параметров клеточного и цитокинового звеньев иммунного ответа при поражении почек у пациентов с ВИЧ-инфекцией.
Материал и методы
В исследование были включены 40 пациентов с ВИЧ-инфекцией, у которых определяли показатели клеточного иммунного ответа и цитокинового статуса. Среди них 30 пациентов с ВИЧ-инфекцией и ХБП (основная группа) от 26 до 46 лет (средний возраст - 31,7±6,2 года, мужчин 60%). ХБП констатировали во всех случаях, когда в течение ≥3 мес выявляли признаки поражения почек: персистирующую протеинурию (ПУ), изменения в осадке мочи, нарушения почечной функции. Функциональное состояние почек оценивали по интегральному показателю, характеризующему степень сохранности/утраты массы действующих нефронов -по величине скорости клубочковой фильтрации (СКФ), мл/мин/1,73 м2, с использованием формул расчета CKD-EPI (Chronic Kidney Desease Epidemiology Collaboration) и MDRD (Modification of Diet in Renal Disease Study) [6]. Критерием нарушения функции почек являлось снижение СКФ <60 мл/мин/1,73 м2.
Группа сравнения - 10 ВИЧ-инфицированных пациентов без маркеров повреждения почек, сопоставимая по полу и возрасту с основной группой. В группу контроля, сопоставимую по полу и возрасту с ВИЧ-инфицированными пациентами, включены 24 здоровых человека, у которых определяли показатели иммунного статуса, и 15 здоровых - для оценки показателей цитокинового профиля.
Критерии включения в контрольную группу: информированное согласие на обследование; отсутствие в анамнезе сведений, позволяющих причислить обследуемых к категории часто и длительно болеющих, имеющих хронические заболевания, патологию почек, признаки иммунодефицитных, инфекционно-воспалительных, аллергических, аутоиммунных состояний.
Показатели типовой иммунограммы определяли на проточном цитофлуориметре "BD FACSCanto II" (Becton Dickinson, США) с помощью станции автоматической пробоподготовки "BD FACS Sample Prep Assistant II" (Becton Dickinson, США). Оценивали абсолютное и относительное число CD3+-, СD3+/CD4+/CD8+-, СD3+/CD4+-, СD3+/CD8+-клеток; иммунорегуляторный индекс (ИРИ); абсолютное и относительное число CD3+/CD56+-, CD19+-, CD3-/CD56+-клеток. Использован стандартизированный комплект моноклональных антител (МКАТ) BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences), содержащий меченые PerCP-Cy5.5 anti-CD45 МКАТ, FITC anti-CD3 МКАТ, PE-Cy7 anti-CD4 МКАТ, APC-Cy7 anti-CD8 МКАТ, APC anti-CD19 МКАТ, PE anti-CD16/anti-CD56 МКАТ.
Показатели в абсолютных величинах рассчитывали по формуле:
Для расчета ИРИ использовали следующую формулу:
В ходе анализа полученных результатов использовали коэффициенты отклонения (КО) для показателей, определяемых у ВИЧ-инфицированных, от контрольных значений здоровых людей. КО рассчитывали по следующей формуле:
Биоматериалом для исследования являлась венозная кровь. Забор крови проводили у пациентов натощак утром в количестве 5,0 мл в пробирки Vacuum Tube EDTA.K3 (цельная кровь).
Концентрацию цитокинов в сыворотке крови исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на многоканальном фотометре "Infinite F50" (фирмы Austria GmbH компании Tecan) с использованием коммерческих диагностических тест-систем: трансформирующий фактор роста β (ТФРβ), интерлейкины-10, -12, -13 (ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13) - Platinum ELISA, eBioscience, Austria; фактор некроза опухолей альфа (ФНОα) - "альфа-ИНТЕР-ФЕРОН-ИФА-БЕСТ"; интерферон γ (ИФН-γ), интерферон а -"гамма-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ" (Новосибирск).
Статистическая обработка результатов выполнена с использованием программы SPSS 17.0 (допустимая ошибка Е=5%).
Результаты и обсуждение
При анализе результатов типового иммунологического исследования клеточного состава лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов при поступлении с наличием (n=30) и отсутствием (n=10) маркеров повреждения почек в сопоставлении с показателями контрольной группы (n=24) выявлено, что для пациентов с ВИЧ-инфекцией характерно снижение в крови содержания Т-лимфоцитов (CD3+) за счет Т-хелперов (CD3+/CD4+) при росте числа цитотоксических Т-клеток (CD3+/CD8+). По сравнению с ВИЧ-инфицированными пациентами без почечной патологии у больных ВИЧ-инфекцией с поражением почек достоверно снижены (р≤0,05) относительное (22,0 и 14,75% соответственно, р=0,005), абсолютное (0,4х109/л и 0,2х109/л соответственно, р=0,015) число CD3+/CD4+-клеток и ИРИ (0,4 и 0,2 соответственно, р=0,014). Кривые отклонения рассчитанных КО в основной и контрольной группах приведены на рис. 1.
Сопоставление иммунологических показателей у больных ВИЧ-инфекцией с учетом уровня ПУ позволило выявить разнонаправленные сдвиги показателей в сторону как их увеличения, так и снижения. Установлено, что при нарастании ПУ отмечали статистически значимое (р<0,05) снижение в крови общего числа лимфоцитов и абсолютного числа Т-лимфоцитов (СD3+) при росте абсолютного числа цитотоксических Т-клеток (CD3+/CD8+). На рис. 2 приведены КО показателей типовой иммунограммы от контрольных значений у ВИЧ-инфицированных пациентов с учетом уровня ПУ.
Реакция иммунной системы у пациентов с ВИЧ-инфекцией и маркерами повреждения почек по сравнению с пациентами контрольной группы также проявилась достоверным снижением процентного (р=0,039) и абсолютного содержания (р=0,027) в крови В-лимфоцитов (CD19+). При ВИЧ-инфекции независимо от наличия патологии почек отмечено достоверно значимое снижение естественных киллеров (CD3-/CD56+) в крови по относительным и абсолютным величинам по сравнению с контролем (6,85 и 15,0% соответственно, р=0,003); (0,1х109/л и 0,25х109/л соответственно, р<0,001), что характерно для хронической вирусной инфекции [7, 8].
Таким образом, у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП были обнаружены разнонаправленные изменения в показателях типовых иммунограмм. Повреждение почек развивалось на фоне более выраженного падения содержания в крови Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов, основной в иммунных механизмах развития заболевания [9, 10].
По результатам определения цитокинового статуса в крови больных ВИЧ-инфекцией с маркерами повреждения почек и при отсутствии таковых в сопоставлении с данными группы контроля выявлено, что у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП преобладал иммуносупрессорный цитокиновый профиль, о чем свидетельствовало возрастание более чем в 50 раз ТФРβ, играющего важную роль в прогрессировании почечного поражения, и увеличение в 4 раза ИЛ-10 на фоне снижения ИФН-γ, ИЛ-13. Анализ показателей цитокинов в группах с наличием и отсутствием ПУ позволил установить, что при ВИЧ-инфекции с поражением почек уровень ИЛ-10 был выше на 74%. Принимая во внимание противовоспалительную роль ИЛ-10, его усиленная продукция может приводить к истощению противовоспалительной системы почки и способствовать переходу острого воспаления в хроническое с последующей трансформацией активного инфильтративного процесса в фиброгенез [11].
При сопоставлении уровней цитокинов при ВИЧ-инфекции с учетом наличия и отсутствия ПУ было установлено статистически значимое повышение ИФН-γ в группе пациентов с поражением почек (79,7 и 70,2 пг/л соответственно, р=0,024), что свидетельствует о выраженном падении числа Т-хелперов 1-го типа (Тh1), которые продуцирует данный цитокин; это совпало с данными по изучению клеточного состава субпопуляции лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов [12]. С хелперной популяцией Т-лимфоцитов были связаны уровни цитокина профиброзного действия - ИЛ-13, контролирующего гуморальный иммунный ответ (r=0,671, р=0,034), и ФНОα (r=-0,733, р=0,025), регулирующего секрецию ТФРβ. Выявленная динамика изменения ИЛ-13 как цитокина, продуцируемого Т-хелперами 2-го типа (Th2), может свидетельствовать о нарушении баланса субпопуляций СD4+-лимфоцитов 1-го и 2-го типов в пользу Тh2. Как известно, Т-хелперы 1-го и 2-го типов участвуют в различных ответных реакциях на патогенное воздействие инфекционных агентов, при этом нарушение баланса цитокин-продуцирующей активности Тh1 и Тh2 играет немаловажную роль в развитии аутоиммунных состояний, прогрессировании и хронизации заболеваний. В свою очередь, гиперпродукция цитокинов приводит к формированию системных воспалительных реакций [13, 14].
Анализ показателей цитокинового статуса у пациентов с поражением почек при нарастании ПУ выявил достоверное повышение значения ИЛ-12 с тенденцией к увеличению уровня ФНОα. Известно, что ИЛ-12 - цитокин, продуцируемый антиген-презентирующими клетками, способствует дифференцировке Т-хелперов в Тh1, и повышение этого интерлейкина может быть компенсаторным механизмом, поскольку при ВИЧ-инфекции наблюдается угнетение Тh1 [7].
Не исключается, что выявленная тенденция может быть предиктором повреждения почек при ВИЧ-инфекции, но для подтверждения этого факта необходимо проведение специальных исследований.
При ВИЧ-инфекции на фоне прогрессирующего иммунодефицита происходит изменение как субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток, так и цитокиновых показателей. У ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек при снижении уровня СD4+-лимфоцитов <200 клеток/мкл и повышении концентрации РНК ВИЧ в крови >100 000 копий/мл отмечено увеличение уровней большинства цитокинов, в том числе ТФРβ. Статистически значимое повышение уровня выявлено только для ФНОα (при уровне СD4+-лимфоцитов более и менее 200 клеток/мкл - 19,0 и 24,2 пг/мл соответственно, р=0,017; при уровне РНК ВИЧ более и менее 100 000 копий/мл - 24,4 и 19,7 пг/мл соответственно, р=0,012). По данным опубликованных исследований, ФНОα усиливает пролиферацию клеток, способствуя активации репликации вируса [15]. В результате по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции с усилением продукции ФНОα увеличивается концентрация РНК ВИЧ, что и было выявлено у ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек (рис. 3).
На рис. 4 приведены результаты корреляционного анализа между уровнями исследуемых цитокинов и маркерами повреждения почек. Установлена прямая положительная корреляционная связь ПУ с ФНОα (r=0,683; р=0,042), СКФ с ИЛ-13 (r=0,667, р=0,050) и отрицательная корреляционная связь СКФ с ФНОα (r=-0,755, р=0,031).
В научной литературе описано, что при ВИЧ-инфекции модификации экспрессии медиаторов воспаления, вызванные белками вируса, приводят к необратимым изменениям в иммунной системе [8, 16]. Важную роль отводят ФНОα, который усиливает пролиферацию Т-клеток, активирует экспрессию генов ВИЧ и инициирует активацию репликации вируса, находящегося в дремлющем состоянии [14, 17]. Гиперпродукция ФНОα вызывает целый ряд нарушений в иммунной системе, способствующих более быстрому прогрессированию болезни с поражением различных органов, в том числе почек.
По данным T. Wada и соавт. [18], при длительном повреждении ткани органов происходит значительное накопление в крови гуморальных медиаторов воспаления, оказывающих влияние как на клетки органа-мишени, так и на основные клеточные элементы воспаления, привлекая их в очаг альтерации. В почке они представлены мезангиальными, проксимальными тубулярными клетками, фибробластами, макрофагами.
Активированные мезангиальные клетки и макрофаги становятся основными источниками локальной гиперпродукции, ауто-/паракринного (на синтезирующую их клетку/соседние клетки) действия провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6) и ростовых факторов (ТФРβ, тромбоцитарного фактора роста), которые непосредственно вызывают гломерулярное повреждение, а также стимулируют клеточную пролиферацию, активацию мезангиоцитов и продукцию ими мезангиального матрикса.
Как было продемонстрировано в ряде исследований, именно ФНОα вместе с ИЛ-1, ИЛ-6 способствует активации мезангиальной пролиферации при волчаночном нефрите, пролиферативных формах воспалительных поражений почечного клубочка, IgA-нефропатии, а ТФРβ как активатору синтеза основных компонентов экстрацеллюлярного матрикса (фибронектина, коллагена, протеогликанов) отводят важную роль в формировании гломерулосклероза, фиброза [19, 20].
Повышенный синтез провоспалительного цитокина ФНОα, обладающего фиброгенным эффектом и способствующего продукции факторов роста, в том числе ТФРβ, может способствовать пролиферации фибробластов посредством стимуляции эпителиально-мезенхимальной реакции. Все это приводит к изменению процессов деградации матрикса и развитию коллагеноза с последующим исходом в фиброз [11, 21]. Отмечено, что у больных ВИЧ-инфекцией с нефропатией определяют высокие концентрации ФНОα в крови. По всей видимости, выявленные изменения в системе медиаторов воспаления у ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек являются результатом привлечения макрофагов в почечный интерстиций и отражают активность патологического процесса в почках. При этом уровень ФНОα, по данным исследования, прямо коррелировал с протеинурией и обратно - со СКФ. Кроме того, ФНОα, источником которого являются клетки воспалительного инфильтрата, может не только вызывать поражение клубочков, но и участвовать в повреждении канальцевого эпителия, что обусловливает формирование тубулоинтерстициальных изменений, присоединение которых способствует прогрессированию ХБП [22]. Снижение уровня клубочковой фильтрации коррелирует со степенью тубулоинтерстициальных изменений, характеризующихся повреждением канальцевого эпителия и формированием интерстициального фиброза в результате продукции провоспалительных цитокинов (ФНОα) и факторов роста (ТФРβ). Такие корреляции также были выявлены в ходе проведенного исследования.
Полученные данные свидетельствуют о важной роли ФНОα в развитии и прогрессировании хронического воспаления. Следует отметить, что ФНОα участвует в тех же патологических процессах, происходящих в почках у пациентов с хроническим гломерулонефритом, не инфицированных ВИЧ.
Однако выявленные нарушения регуляции продукции цитокинов у ВИЧ-инфицированных пациентов с почечной патологией пока относятся к одним из первых исследований в этой области.
На основании опубликованных данных [23, 24] и результатов проведенного исследования установлено, что отмечается статистически значимое повышение уровня ФНОα на фоне СD4+-лимфоцитов <200 клеток/мкл и РНК ВИЧ >100 000 копий/мл.
Таким образом, оценка динамики изменения параметров иммунного и цитокинового статуса у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП свидетельствовала о преобладании у них провоспалительных и иммуносупрессорных реакций с гиперэкспрессией сывороточных цитокинов ТФРβ, ФНОα. Установлена ведущая роль ФНОα в сочетании с депрессией иммунной системы и высокой виремией РНК ВИЧ в повреждении почек. Полученные данные расширяют понимание патогенетических механизмов хронического почечного поражения при ВИЧ-инфекции, а исследования в этой области откроют широкие возможности для прогнозирования течения и исхода ХБП.